Szybkie oznaczanie progu termicznej nocycepcji u szczurów z cukrzycą
17 maja 2012
W niniejszym opracowaniu opisujemy szybką, niezawodną i prostą procedurę określania najniższej temperatury, przy której szczury lub myszy wykazują zachowania nocyfencyjne, t. j. na próg termicznej nocycepcji (TNT). Metoda ta wykorzystuje powoli zwiększający się bodziec termiczny, co pozwala na precyzyjną i powtarzalną ocenę TNT przy minimalnym lub żadnym stresie dla zwierząt.
Ogólnym celem tej procedury jest wyznaczenie termicznego progu nocyceptywnego u szczurów kontrolnych oraz szczurów z cukrzycą. W pierwszym kroku zwierzę umieszcza się na inkrementalnej płycie grzejnej z miernikiem analgezji. Następnie, podczas nagrzewania powierzchni, temperatura płyty grzejnej jest stopniowo zwiększana.
Obserwuje się zwierzę pod kątem wystąpienia reakcji obronnych. W momencie zaobserwowania takiego zachowania przerywa się ogrzewanie i zapisuje aktualną temperaturę płytki. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące zmiany progu nocycepcji termicznej u zwierząt leczonych lekami przeciwbólowymi lub cierpiących na bolesną neuropatię cukrzycową.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak płytka grzejna, która zazwyczaj jest ustawiona na temperaturę przekraczającą próg, jest fakt, że nasze metody stopniowo zwiększają temperaturę płytki, co pozwala na dokładne określenie progu termicznej nocycepcji. Próg termicznej nocycepcji (TNT) jest wyznaczany przy użyciu inkrementalnego miernika analgezji na płytce grzejnej (IHpam). Komponenty tego systemu obejmują pleksiglastową komorę obserwacyjną, aluminiową płytkę z kontrolą temperatury, klawiaturę służącą do programowania oraz przełącznik nożny do zdalnego sterowania urządzeniem.
Dane są gromadzone za pomocą specjalistycznego oprogramowania na pobliskim komputerze. Alternatywnie można wydrukować kopie papierowe, korzystając z portu szeregowego znajdującego się w urządzeniu. Za komorą z pleksiglasu należy umieścić lustro, aby zwiększyć widoczność zachowania zwierzęcia.
Następnie ustaw pożądane szybkości nagrzewania oraz początkową temperaturę stanu gotowości i końcową temperaturę odcięcia. Naciśnij przełącznik nożny, aby uruchomić i zatrzymać system. Potwierdź, że początkowa temperatura stanu gotowości oraz końcowa temperatura odcięcia zostały zapisane, a także czas potrzebny na osiągnięcie temperatury końcowej.
W razie potrzeby badacz może przetestować system na sobie, cofając rękę z metalowej płyty w momencie odczucia bólu. Percepcja nie może spowodować uszkodzenia skóry ani nie może wywołać późniejszego dyskomfortu.
Rozpocznij aklimatyzację wieczorem dnia poprzedniego, ustawiając klatki na blacie, na którym będą przeprowadzane testy. Na dwie godziny przed testowaniem włącz urządzenie IH, aby zwierzęta oswoiły się z hałasem generowanym przez jednostkę.
Na tym etapie system można skonfigurować i przetestować zgodnie z wcześniejszymi opisami. Po tym, jak zwierzęta zaadaptują się do środowiska, delikatnie umieść szczura w pleksiglasowej komorze na rozgrzanej powierzchni. Pozwól zwierzęciu badać komorę przez kilka minut.
Rozpocznij testowanie. Gdy zwierzę będzie wydawać się spokojne i gotowe do rozpoczęcia próby, naciśnij przełącznik nożny, aby rozpocząć ogrzewanie płyty. Obserwuj zachowanie zwierzęcia podczas nagrzewania się płyty.
Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności, ponieważ identyfikacja agresywnego zachowania masowego nie zawsze jest jednoznaczna i wymaga praktyki. Żadne zachowania agresywne nie charakteryzują się lizaniem, potrząsaniem lub unoszeniem któregokolwiek z tylnych porów. Warto zauważyć, że pierwszym zaobserwowanym zachowaniem może być lizanie czterech porów, po którym następuje reakcja tylnych porów.
W przypadku zaobserwowania najbardziej nasilonej reakcji obronnej, należy nacisnąć przełącznik nożny, aby zakończyć próbę i przenieść zwierzę z powrotem do klatki domowej. Temperatura wywołująca taką reakcję jest uznawana za termiczny próg nocyceptywny lub TNT zwierzęcia kontrolnego. Urządzenie zostaje oczyszczone, a test powtórzony dla kolejnego zwierzęcia.
Poniżej przedstawiono progi termicznej nocycepcji u zdrowych młodych dorosłych szczurów i myszy. Dane wskazują, że TNT szczurów nie uległo zmianie podczas testów przeprowadzanych w ciągu czterech dni. Podobnie TNT myszy pozostawało spójne w różnych grupach wiekowych.
W tym przykładzie wielokrotnie mierzono TN TS młodych dorosłych szczurów z cukrzycą indukowaną STZ. Stały spadek progów termicznej nocycepcji jest widoczny poczynając od dwóch tygodni po indukowaniu cukrzycy. Tutaj zastosowano IH pam w celu przetestowania ostrych właściwości antynocyceptywnych związku przeciwbólowego.
Związek A wywołał łagodne działanie przeciwbólowe u zwierząt kontrolnych w porównaniu z grupą otrzymującą nośnik. Jednakże przeciwbólowanie było bardziej wyraźne u zwierząt z cukrzycą otrzymujących związek w porównaniu z kontrolą z nośnikiem. Podczas wykonywania tej procedury bardzo ważne jest ciągłe monitorowanie zachowania zwierzęcia, w szczególności reakcji występujących w pobliżu jego kończyny.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje prostą i niezawodną procedurę wyznaczania termicznego progu nocyceptywnego (TNT) u szczurów i myszy. Metoda ta polega na stosowaniu stopniowo zwiększanego bodźca termicznego w celu dokładnego oszacowania TNT przy minimalnym stresie dla zwierząt.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Analiza behawioralna
- Nocycepcja termiczna
Wstęp
- Zrozumienie zachowań nocyceptywnych jest kluczowe dla badań nad bólem.
- Termiczny próg nocycepcji jest kluczowym parametrem w ocenie wrażliwości na ból.
- Istniejące metody mogą wywoływać stres u zwierząt, co wpływa na wyniki.
- Celem niniejszego badania jest dostarczenie alternatywy o mniejszym potencjale stresogennym.
Cel badania
- Wyznaczenie progu termicznej nocycepcji u szczurów kontrolnych i cukrzycowych.
- Ocena wpływu leków przeciwbólowych na zachowanie nocyceptywne.
- Ocena zmian TNT związanych z bolesną neuropatią cukrzycową.
Zastosowane metody
- Umieszczenie zwierzęcia na płycie grzejnej z programowalnym wzrostem temperatury.
- Stopniowe zwiększanie temperatury płyty grzejnej.
- Obserwacja zwierzęcia pod kątem wystąpienia zachowań nocyfencyjnych.
- Zapisanie temperatury, przy której zaobserwowano zachowanie nocyfencyjne.
Główne wyniki
- Dokładny pomiar TNT przy minimalnym stresie dla zwierząt.
- Zdolność do wykrywania zmian w TNT w wyniku leczenia przeciwbólowego.
- Wnioski dotyczące wpływu neuropatii cukrzycowej na wrażliwość na ból.
- Powtarzalność wyników w różnych próbach.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia wiarygodną ocenę progów nocycepcji termicznej.
- Może być ona wykorzystywana do oceny skuteczności strategii leczenia bólu.
- Podejście to pozwala na lepsze zrozumienie mechanizmów bólu w modelach zwierzęcych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Precyzyjny pomiar progu termicznej nocycepcji (TNT) umożliwia obiektywną ocenę wrażliwości na ból w przedklinicznych modelach neuropatii cukrzycowej, co wspiera walidację celów terapeutycznych oraz testowanie skuteczności analgetyków. Powtarzalność tej metody oraz jej czułość na stany hiperalgezji zapewniają wiarygodność prognostyczną, pozwalającą na ograniczenie ryzyka w przypadku kandydatów na leki przeciwbólowe przed przejściem do badań na późniejszych etapach. Podejście to rozwiązuje kluczowy problem w badaniach nad bólem, oferując mierzalny i istotny translacyjnie punkt końcowy do oceny mechanistycznej i terapeutycznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych związanych ze szlakami bólowymi oraz mechaniczną ocenę ryzyka celów terapeutycznych zaangażowanych w hiperalgezję termiczną.
- Wartość operacyjna: Zapewnia czuły, ilościowy odczyt do oceny stopnia zaangażowania celu w modelach neuropatii cukrzycowej.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfelu poprzez wykrywanie zmian w TNT związanych z leczeniem przeciwbólowym, dostarczając informacji dla decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go).
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość analizy: Tworzy zestandaryzowaną, powtarzalną platformę do oceny wpływu związków na nocycepcję termiczną.
- Wynik ilościowy: Generuje ciągłe pomiary TNT, które umożliwiają analizę zależności dawka-odpowiedź oraz ranking związków.
- Skalowalność: Kompatybilność z badaniami wysokoprzepustowymi dzięki zautomatyzowanym protokołom zwiększania temperatury i obserwacji behawioralnej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Bezpośrednio modeluje hiperalgezję w bolesnej neuropatii cukrzycowej, która jest kluczowym objawem PDN.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkrywania z walidacją przedkliniczną, zapewniając konserwatywny wskaźnik wrażliwości na ból u różnych gatunków.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Wspiera obiektywne podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju związku na podstawie zmian TNT u zwierząt z cukrzycą w porównaniu z grupą kontrolną.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne badania skuteczności, w szczególności w programach dotyczących OUN i leków przeciwbólowych ukierunkowanych na ból neuropatyczny.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez dotyczących dróg nocyceptywnych oraz biologiczną weryfikację celu terapeutycznego zaangażowanego w hiperalgezję cukrzycową.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne dane dotyczące wrażliwości termicznej na potrzeby kampanii przesiewowych związków chemicznych.
- Analityka: Pozwala na uzyskanie mierzalnych wartości TNT, co umożliwia statystyczne porównanie skuteczności analgetycznej oraz postępu neuropatii.
- Badania translacyjne: Jest spójne ze strategiami biomarkerowymi, zapewniając funkcjonalny korelat wrażliwości na ból w modelach cukrzycy.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma wielokrotnego użytku w programach odkrywania leków przeciwbólowych wymagających obiektywnego pomiaru punktu końcowego bólu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w modulacji szlaków bólowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność w różnych laboratoriach i ośrodkach badawczych.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wcześniejszą identyfikację nieskutecznych leków przeciwbólowych dzięki czułemu wykrywaniu TNT.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka na podstawie wykazanych efektów w modelach neuropatii cukrzycowej.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu neuronauki behawioralnej i rozpoznawania zachowań nocyceptywnych.
- Zależne od skalibrowanego analizatora przeciwbólowego z płytą grzejną o zmiennej temperaturze oraz systemów kontroli temperatury.
- Wymaga zestandaryzowanego szkolenia obserwatorów w celu zapewnienia spójności w wykrywaniu reakcji nocyceptywnych.
- Obejmuje protokoły aklimatyzacji w celu zminimalizowania stresu środowiskowego i zmienności poziomu bazowego.
- Ograniczone do modalności termicznej; nie ocenia nocycepcji mechanicznej ani chemicznej bez zastosowania dodatkowych testów.
