Lokalne i globalne metody oceny nocycepcji termicznej u larw Drosophila

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena nocycepcji termicznej u larw Drosophila. Osiąga się to poprzez pobranie larw Drosophila, a następnie poddanie ich szkodliwym bodźcom termicznym; w opcjonalnym drugim kroku larwy mogą zostać poddane naświetlaniu promieniami UV, co powoduje uszkodzenie tkanek i uwrażliwienie nocyceptywne na temperaturę. Następnie larwy można badać lokalnie za pomocą sondy grzewczej lub globalnie przy użyciu płyty grzejnej, aby wywołać reakcje nocyceptywne, które można zmierzyć ilościowo.

Sonda termiczna wykazuje, że larwy mają górny limit odpowiedzi nocyceptywnej na ciepło oraz zaskakującą zależność między temperaturą bodźca a amplitudą wywołanej odpowiedzi. Test na płycie grzejnej pokazuje, że larwy wykazują stereotypową sekwencję zachowań nocyceptywnych, które zależą od temperatury otaczającej wody i aktywności nocyceptywnych neuronów sensorycznych. Opisane tutaj metody mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie nocycepcji termicznej, takie jak to, czy zwierzęta reagują inaczej na szkodliwe bodźce termiczne prezentowane lokalnie lub globalnie.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z testem sondy termicznej napotykają trudności, ponieważ opanowanie tej metody wymaga praktyki w celu zminimalizowania zmienności nacisku, miejsca przyłożenia oraz kąta prowadzenia sondy. Wizualna demonstracja testu płyty grzewczej jest kluczowa, ponieważ zachowania wywołane rosnącą temperaturą najlepiej ocenić poprzez bezpośrednią obserwację. Aby uzyskać wystarczającą liczbę larw potomstwa o określonym genotypie, należy hodować pożądany szczep bezpośrednio lub przeprowadzić krzyżówki w butelkach z pożywką dla muszek, używając 20 do 30 dziewiczych samic i 15 do 20 samców. Pięć dni po zniesieniu jaj należy zebrać i oczyścić wczesne larwy trzeciego stadium, usuwając rozmokłą pożywkę i przemywając je delikatnie bieżącą wodą przez sito o rozmiarze oczek 630 micron. Wczesne larwy trzeciego stadium należy przenieść na małą, wilgotną porcję pożywki, aby zapobiec ich głodowaniu i wysychaniu.

Po przygotowaniu komory anestezji, za pomocą pęsety lub pędzelka ostrożnie umieść 10 larw z wczesnego trzeciego stadium rozwojowego wzdłuż wewnętrznej strony pokrywy i zamknij ją. Pracując w dygestorium, umieść komorę anestezji w słoiku sprzęgającym, w którym znajduje się zlewka o pojemności 10 mililitrów z kulką waty nasączoną 1,5 mililitrami eteru etylowego. Zakręć nakrętkę słoika sprzęgającego, aby poddać larwy działaniu oparów eteru przez 2 do 2,5 minuty.

Po znieczuleniu wyjmij komorę do znieczulania z naczynia Coplana i odczekaj kilka sekund w dygestorium, aż resztki oparów eteru ulotnią się. Za pomocą butelki z wodą ostrożnie wypłucz larwy z komory do małej szalki Petriego. Osusz znieczulone larwy za pomocą papierowego ręcznika, a następnie delikatnie przymocuj je grzbietem do góry na pasku dwustronnej taśmy klejącej przyklejonej do szkiełka przedmiotowego o wymiarach trzech na jeden cal.

Umieść preparas na dolnej powierzchni komory do naświetlania UV i poddaj larwy działaniu światła UV przez sześć sekund przy natężeniu 20 millijoules per centimeter squared. Po naświetlaniu zanurz preparas w wodzie, aby delikatnie oddzielić larwy od dwustronnej taśmy klejącej. Za pomocą pęsety lub pędzla ostrożnie przenieś naświetlone larwy do naczynia o wymiarach 15 by 45 millimeter.

Szklana fiolka hodowlana o pojemności jednej dramy zawierająca jeden mililitr pożywki dla much, w której larwy powinny regenerować się od ośmiu do 24 godzin w temperaturze 25 °C lub pożądanej temperaturze hodowli przed ponownym przeniesieniem. W przypadku testów nocycepcji termicznej należy najpierw ustawić temperaturę sondy termicznej na pożądany punkt nastawy. Za pomocą pędzla lub pęsety należy delikatnie przenieść pojedynczą larwę na płaską platformę, upewniając się, że larwa jest pokryta cienką warstwą wody.

Aby zminimalizować różnice w nacisku oraz zapewnić prawidłowe położenie i kąt wprowadzenia sondy termicznej, kluczowa jest wprawa. Delikatnie dociśnij końcówkę sondy do larwy na wysokości segmentu A4, wywierając lekki nacisk pod kątem około 45 stopni między sondą a powierzchnią ciała larwy. Nacisk ten powinien spowodować niewielkie wgłębienie na powierzchni larwy i zazwyczaj jest wystarczający, aby zapobiec jej poruszaniu się.

Kontynuuj stymulację larw, aż do wystąpienia reakcji wycofania lub do momentu osiągnięcia 22. punktu odcięcia. Larwy reagujące zazwyczaj najpierw wykazują wstępne zachowanie polegające na unoszeniu głowy i ogona, po czym następuje zachowanie wycofania w postaci obrócenia się o co najmniej 360 stopni. Po zainicjowaniu zachowania wycofania przerwij kontakt z sondą i zarejestruj latencję lub czas potrzebny na wycofanie.

Jeśli w ciągu 20 sekund nie zaobserwowano reakcji wycofania, larwa zostaje uznana za osobnika nieodpowiadającego. Ustaw światłowodowe przewodniki światła tak, aby zapewnić odpowiednie oświetlenie o wysokim kontraście. Aby obejrzeć larwy, umieść blok grzejny w płycie grzejnej płaską powierzchnią do góry, a następnie ustaw płytę grzejną na podstawie mikroskopu.

Włącz płytkę grzejną na wysoką moc i odczekaj około 15 minut, aż temperatura ustabilizuje się na poziomie 95 stopni Celsjusza. Odmierz 80 µL wody destylowanej i za pomocą mikropipety nanieś kroplę wody na środek polistyrenowej szalki Petriego o wymiarach 60 na 15 mm. Używając pęsety, delikatnie umieść czystą larwę w połowie trzeciego stadium rozwojowego na środku kropli wody, wprowadzając jak najmniej dodatkowej wody.

Ostrożnie umieść szalkę Petriego na stałym bloku grzewczym na płycie grzejnej. Szybko skoryguj położenie szalki tak, aby cała larwa i kropla wody były widoczne. Uruchom stoper.

W tym momencie szalkę Petriego umieszcza się na stałym bloku grzejnym płyty grzewczej i odnotowuje czas wystąpienia każdego z zachowań. Obserwuje się stereotypowe zachowania lokomocyjne po przeniesieniu larwy zanurzonej w wodzie na płytę grzewczą. Normalne zachowanie w przypadku braku ciepła obejmuje lokomocję parasolowatą, której towarzyszą poszukujące ruchy głowy.

Następnie może wystąpić zachowanie określane jako gwałtowne potrząsanie głową (head thrash), podczas którego larwa szybko porusza głową w kierunku przednim lub bocznym. Ruch ten jest podobny do ich normalnego przemieszczania się w wodzie, lecz odbywa się w sposób bardziej szarpany i z uporczywym obracaniem. Zachowanie to jest odnotowywane, gdy larwy obracają się bokiem o co najmniej pełne 360 stopni.

Może to zdarzyć się różną liczbę razy, a czasami obejmuje niepełne obroty. W celu oceny tego zachowania należy liczyć wyłącznie pełne obroty o 360 stopni. Zachowanie to jest najbardziej zbliżone do sceny z lokalnym przykładaniem sondy termicznej podczas zachowania typu „whip”.

Larwa wykazuje szybkie ruchy skurczowo-rozkurczowe wzdłuż osi przednio-tylnej, które sprawiają, że głowa bardzo krótko zbliża się do ogona. Ruchy smagające są często obserwowane w szybkiej sekwencji, dwiema seriami lub jednocześnie z toczeniem. Na koniec larwa wykazuje zachowania przypominające drgawki, po których często następuje paraliż. Podczas drgawek larwa wyciąga się wzdłuż osi przednio-tylnej i wykazuje wysoką częstotliwość drżeń całego ciała.

Zachowanie polegające na drżeniu bez paraliżu z wygięciem występuje, gdy larwy przestają się poruszać. U niektórych larw jest to stan trwały, podczas gdy inne wykazują następnie ruch pulsacyjny o niskiej częstotliwości. Na tym wykresie procentu osobników odpowiadających w każdej kategorii widoczny jest limit odpowiedzi nocycepcyjnej larw na ciepło. W teście z sondą termiczną 100% larw reaguje szybko do temperatury sondy 52 °C.

Jednak w temperaturze 54°C i wyższej 90% lub więcej larw nie reaguje nawet po 20 sekundach kontaktu. Choć larwy te nadal poruszają się po 22. odcięciu, można również zmierzyć i wykreślić liczbę obrotów lub czas trwania zachowania wycofania w reakcji na bodziec awersyjny. Co zaskakujące, wydaje się istnieć odwrotna zależność między temperaturą sondy a intensywnością reakcji, gdyż niższe temperatury zdają się wywoływać większą liczbę obrotów.

Po przeniesieniu larwy zanurzonej w wodzie na płytkę grzejną obserwuje się pięć stereotypowych zachowań lokomocyjnych. Przedstawiono tutaj średnie czasy latencji, w których obserwuje się te zachowania, a także średnie temperatury kropli wody zmierzone dla każdej latencji w optymalnych warunkach testu opisanych w niniejszej pracy; odsetek larw wykazujących każde z tych charakterystycznych zachowań mieścił się w granicach od 77 do 100%, choć sporadycznie zachowania takie jak toczenie się (rolling) i smaganie (whipping) są pomijane, nakładają się na siebie lub występują w odwrotnej kolejności. Przedstawiono tutaj odsetek larw, które przeżyły po wystąpieniu paraliżu w teście na płytce grzejnej. Larwy były podgrzewane aż do momentu wystąpienia paraliżu, a następnie przeniesione do standardowych warunków hodowli w celu rekonwalescencji.

Larwy z grupy kontrolnej (mock) poddano analogicznym zabiegom, z wyjątkiem ekspozycji na wysoką temperaturę, a tworzenie PPE u żyjących osobników dorosłych ilościowo oceniano między siódmym a trzynastym dniem. W tym układzie MD G four napędza ekspresję transgenów regulowanych przez UAS we wszystkich czterech klasach wielkodendrytycznych obwodowych neuronów sensorycznych. UAS or one delta C wykazuje ekspresję zmodyfikowanej wersji drosophila otwieranego potencjałowo kanału potasowego niezbędnego do transmisji synaptycznej, natomiast UAS orrc one delta NC wykazuje ekspresję dodatkowo zmodyfikowanej wersji tego samego kanału, która nie zakłóca transmisji synaptycznej.

Należy zauważyć, że tylko larwy posiadające zarówno driver MD GAL4, jak i transgen UAS ORC delta C wykazują zwiększone opóźnienia w czterech z pięciu obserwowanych zachowań. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat pomiaru lokalnych i globalnych odpowiedzi larw Drosophila na szkodliwe bodźce termiczne. Procedury te można łączyć z innymi metodami, takimi jak analiza genetyczna, w celu zidentyfikowania genów niezbędnych do nocycepcji termicznej. Podczas przeprowadzania testu z sondą grzewczą ważne jest, aby dążyć do zminimalizowania zmienności w zakresie nacisku, lokalizacji oraz kąta kontaktu sondy.