Analiza pojedynczych komórek biofilmu Bacillus subtilis przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja i ilościowe określenie odrębnych subpopulacji wyspecjalizowanych komórek, które różnicują się w biofilmach organizmu modelowego, Bacillus subtilis. Zostaje to osiągnięte poprzez uprzednie wprowadzenie reporterów transkrypcyjnych do chromosomu B. subtilis. Reportery te będą ekspresjonowane wyłącznie w badanej subpopulacji komórek.

Kolejnym krokiem jest stymulacja rozwoju biofilmu poprzez hodowlę B subtles w medium indukującym biofilm, Ms GG gg. Po utworzeniu biofilmu komórki z biofilmu są rozproszone i utrwalone paraformaldehydem. Ostatnim etapem procedury jest detekcja sygnału fluorescencji emitowanego przez pojedyncze komórki społeczności mikrobiologicznej przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej.

Ostatecznie wyniki pokazują, w jaki sposób komórki wyspecjalizowane w produkcję i wydzielanie macierzy zewnątrzkomórkowej, która tworzy biofilm, stanowią inną subpopulację niż komórki wydzielające surfaktant — cząsteczkę sygnałową odpowiedzialną za różnicowanie subpopulacji producentów macierzy. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak ilościowe oznaczanie ekspresji transkrypcyjnej za pomocą testów żywotności lub analizy mikromacierzy, jest to, że pozwala ona na monitorowanie ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki oraz wizualizację szczególnie małych populacji komórek wyspecjalizowanych w ekspresji konkretnego genu.

Ekspresja tych genów nie zostanie wykryta podczas analizy całej populacji. Do znakowania szczepów B subtles stosuje się plazmidy integracyjne, a przykład przedstawiono tutaj. PTAA to promotor genów odpowiedzialnych za produkcję tass.

Białko macierzy zostaje sklonowane do wektora przy użyciu miejsc restrykcyjnych EcoRI i HindIII. Ekspresja genu reporterowego CFP znajduje się teraz pod kontrolą ptapA. Aby rozpocząć procedurę znakowania B. subtilis, należy zlinearyzować plazmid integracyjny poprzez trawienie enzymatyczne. Zalecanym enzymem restrykcyjnym jest XhoI. Po przygotowaniu plazmidu integracyjnego należy indukować naturalną kompetencję szczepu B. subtilis 168, hodując komórki w medium indukującym kompetencję przez 5 godzin w temperaturze 37 °C.

Dodaj zlinearyzowany plazmid do hodowli kompetentnych komórek B. subtilis i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 °C. Po dwóch godzinach wysiej komórki na agar z spektomycyną i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C. Chromosom B. subtilis posiada dwa locus neutralne, Amy E i LAC A, które mogą być wykorzystane do integracji fuzji reporterowych bez wpływu na rozwój biofilmu. Zlinearyzowany plazmid PKM 0 0 8 integruje się z genomem B. subtilis poprzez podwójną rekombinację.

Kolejnym krokiem jest przeniesienie reporteru z oznakowanego szczepu do szczepu zdolnego do tworzenia biofilmu, korzystając z protokołu transdukcji fagowej SPP one. Na potrzeby tego filmu przedstawiono jedynie najważniejsze etapy protokołu. Hoduj szczep donora 1 68, zawierający fuzję reporterową, w pożywce TY w temperaturze 37°C, aż kultura osiągnie wczesną fazę stacjonarną, a następnie w szklanej probówce wymieszaj 200 µL komórek z 100 µL rozcieńczonego zapasu fagów.

Następnie inkubujmy w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Dalej, pipetuj gorący agar miękki TY do probówki i dokładnie wymieszaj za pomocą wirułki. Delikatnie rozprzestrzen zawiesinę na świeżej płytce z agarem TY i inkubuj w temperaturze 37 °C od 8 do 16 godzin, aby umożliwić powstanie halo fagowych.

Aby zebrać halo fagowe, dodaj trzy mililitry medium TY na płytkę i za pomocą szklanej pipety rozbij górną warstwę agaru. Przenieś zawiesinę agarową do probówki typu Falcon o pojemności 15 mililitrów. Delikatnie wymieszaj na wortexie, aby rozbić agar, a następnie wiruj w wiroworce przy 1000 G przez 15 minut.

Przenieś supernatant do nowej probówki. Przepuść supernatant przez strzykawkowy filtr o rozmiarze oczek 22 µm. Wykorzystaj ten supernatant do zakażenia hodowli szczepu biorcy wyhodowanej w medium TY.

Dodaj 30 µL supernatantu do 10 mL hodowli rozcieńczonej 1:10 i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Następnie odwiruj w wirówce z prędkością 5 000 RPM przez siedem minut, resuspenduj osad w 200 µL pożywki TY i wysiej na płytkę zawierającą SPECTmycin oraz 10 mM cytrynianu sodu.

Inkubować w temperaturze 37 °C przez 12 do 36 godzin. Wybrać kolonię i hodować ją przez noc w płynnym podłożu LB w temperaturze 37 °C. Na koniec nanieść trzy µL kultury nocnej na stałe podłoże indukujące biofilm.

Pozostawić komórki do wzrostu na 72 godziny w temperaturze 30 °C. Po trzech dniach wzrostu biofilmy utworzone na powierzchni agaru Ms.GG wykształcą złożoną architekturę morfologiczną na powierzchni agaru. Aby rozpocząć tę procedurę, należy za pomocą wykałaczki lub pęsety usunąć biofilm z powierzchni agaru MSGG.

Konsystencja biofilmu powinna umożliwiać jego odklejenie od powierzchni agaru. Biofilm należy przenieść w całości do trzech mililitrów buforu PBS, a następnie rozproszyć go za pomocą delikatnego mieszania. Przed przystąpieniem do analizy pojedynczych komórek należy poddać próbki 12 pulsom o mocy trzech i amplitudzie 0,7 sekundy.

Zawiesić 300 µL zawiesiny komórkowej w 1 mL 4% roztworze paraformaldehydu i inkubować w temperaturze pokojowej przez dokładnie siedem minut. Po siedmiominutowej fiksacji przemyć komórki buforem PBS trzy razy. Na koniec zawiesić komórki w 300 µL buforu PBS przed przeprowadzeniem mikroskopii fluorescencyjnej.

Przygotuj szkiełko przedmiotowe, naniosząc pipetą 200 µL 0,8% agros na szkiełko, a następnie ostrożnie przykrywając go drugim szkiełkiem. Po dwóch minutach delikatnie usuń górne szkiełko, aby uzyskać warstwę agros przylegającą do dolnego szkiełka w miejscu aplikacji. Nanieś 2 µL utrwalonych komórek na powierzchnię warstwy agros i przykryj ją szkiełkiem nakrywką.

Umieść próbkę na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego. Ustaw czas naświetlania na podstawie kontroli negatywnej, która nie wykazuje fluorescencji w warunkach wybranych dla eksperymentu. Czas ekspozycji powinien wynosić od 50 do 200 milisekund.

Należy pozyskać obrazy fluorescencyjne oraz obrazy w jasnym polu dla każdego pola widzenia. Aby przygotować komórki do analizy w cytometrii przepływowej, należy rozproszyć próbkę utrwalonych komórek za pomocą łagodnej sonikacji. Wykonaj dwie serie po 12 impulsów o mocy 5 i amplitudzie 0,7 sekundy, aby rozbić skupiska na pojedyncze komórki, nie powodując ich lizy.

Potwierdzić efektywność dyspersji komórek za pomocą mikroskopii świetlnej. Następnie rozcieńczyć próbkę 1:100 w buforze PBS. Do analizy fluorescencji YFP zostanie użyty cytometr przepływowy BD FACSCanto II.

Do fluorescencji CFP wykorzystuje się wzbudzenie laserowe o długości fali 488 nanometrów w połączeniu z filtrem 5 30 30. Wykorzystuje się wzbudzenie laserowe o długości fali 405 nanometrów w połączeniu z filtrem 4 0 8 40, a następnie kalibruje się cytometr przepływowy za pomocą dwóch kontroli negatywnych. Próbka buforu PBS bez zawieszonych komórek powinna służyć jako kontrola negatywna dla wielkości cząstki wykrywanej przez cytometr przepływowy.

Próbka bez reportera fluorescencyjnego powinna służyć jako kontrola negatywna dla czułości fluorescencyjnej cytometru przepływowego. Po kalibracji umieść w cytometrze przepływowym każdą próbkę oznakowaną reporterem fluorescencyjnym; dla każdej próbki przeanalizuj co najmniej 50 000 zdarzeń przy szybkości przepływu od 303 000 zdarzeń na sekundę. Gdy B Subtles rośnie na płytce z pożywką indukującą tworzenie biofilmu MSGG, formowanie biofilmu obserwuje się po trzech dniach inkubacji w temperaturze 30 °C.

Biofilm wykazuje złożoną architekturę morfologiczną, która wskazuje na obecność odrębnych uczestniczących subpopulacji komórek. Na przykład produkcja macierzy zewnątrzkomórkowej i biofilmów prowadzi do powstania zmarszczek na powierzchni kolonii. Rysunek ten przedstawia przykład wizualizacji różnicowania komórek w pojedynczym znakowanym szczepie przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Szczep ten zawiera fluorescencyjny reporter Ptap, A CFP, który jest wyrażany w subpopulacji komórek produkujących macierz, zaznaczonych kolorem niebieskim. Subpopulacja ta produkuje i wydziela macierz zewnątrzkomórkową, z której składa się biofilm. Następny obraz jest wynikiem wizualizacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej szczepu z podwójnym znakowaniem, który zawiera reporter Ptap, A CFP oraz dodatkowy reporter P Surfactin YFP.

Ten drugi reporter umożliwia monitorowanie subpopulacji komórek odpowiedzialnych za wydzielanie cząsteczki sygnałowej surfaktyny, która uruchamia kaskadę sygnałową prowadzącą do różnicowania producentów macierzy. W tym przypadku producenci macierzy są zaznaczeni kolorem niebieskim, natomiast producenci surfaktyny kolorem żółtym; są to wyniki 2D cytometrii przepływowej z użyciem pojedynczego znakowanego szczepu zawierającego reporter ptap. Przedstawiono tutaj YFB.

Niepoddana traktowaniu szczep kontrolny, pozbawiony genów białek fluorescencyjnych, wykazał pojedynczą populację komórek z niską względną fluorescencją przenoszących ptap. Białko YFP w warunkach nieindukujących tworzenia biofilmu nie pozwoliło na odróżnienie subpopulacji producentów macierzy, a cała populacja wykazywała również niską względną fluorescencję. W przeciwieństwie do tego, w warunkach indukujących tworzenie biofilmu, wykryto subpopulację komórek o wysokiej względnej fluorescencji, widoczną jako „ramię” po prawej stronie piku niskiej względnej fluorescencji.

Tutaj przedstawiono wyniki szczytowe uzyskane z trójwymiarowej cytometrii przepływowej. Sygnały fluorescencji monitorowanych kanałów są przedstawione na osi X dla YFP oraz na osi Y dla CFP; górny lewy panel pokazuje szczep pozbawiony genów białek fluorescencyjnych jako kontrolę autofluorescencji. W prawym górnym panelu wykorzystano pojedynczy znakowany szczep do wykrycia subpopulacji producentów surfaktyny w kanale fluorescencji YFP, zaznaczonym żółtą ramką.

Na dolnym lewym panelu użyto innego pojedynczo oznakowanego szczepu do wykrycia subpopulacji producentów macierzy. W kanale fluorescencji CFP obramowanym na niebiesko monitoruje się subpopulacje producentów macierzy i producentów surfaktantów przy użyciu szczepu podwójnie oznakowanego, a wyniki przedstawiono na tym dolnym prawym panelu.

Wykryto dwie subpopulacje komórek wykazujących wysoki poziom ekspresji reporterów fluorescencyjnych. Każda populacja została obramowana, co pokazuje brak nakładania się ekspresji reporterów pomiędzy dwiema subpopulacjami wyspecjalizowanych komórek. Ta końcowa figura przedstawia ilościowe oznaczenie subpopulacji producentów macierzy oraz kanibali za pomocą 3D cytometrii przepływowej.

Na górnym prawym panelu użyto pojedynczego znakowanego szczepu do wykrycia subpopulacji kanibali. W kanale fluorescencji YFP obramowanym na żółto opisano tę subpopulację kanibali, aby odróżnić ją w sposób skoordynowany od subpopulacji producentów macierzy. Na dolnym lewym panelu subpopulacja producentów macierzy jest wykrywana w innym pojedynczo znakowanym szczepie w kanale fluorescencji CFP.

W obramowaniu niebieskim wyniki dla szczepu z podwójnym znakowaniem w prawym dolnym panelu wykazały pojedynczą subpopulację fluorescencyjnych komórek wykazujących ekspresję zarówno YFP, jak i CFP w obramowaniu zielonym. Symultaniczna ekspresja obu reporterów wskazuje, że obie ścieżki różnicowania komórek są koordynowanie aktywowane w tej samej subpopulacji. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wizualizować i kwantyfikować odrębne subpopulacje komórek tworzących mikrobiologiczny biofilm, wykorzystując analizę populacji komórek, taką jak mikroskopia fluorescencyjna lub cytometria przepływowa.