Inżynieria i ewolucja syntetycznych wektorów terapii genowej opartych na wirusach adeno-zależnych (AAV) za pomocą tasowania rodzin DNA

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest stworzenie wysoce zróżnicowanej biblioteki syntetycznych kapsydów wirusów towarzyszących adenowirusom (AAV), z której można wyselekcjonować cząsteczki o pożądanych właściwościach. Osiąga się to poprzez fragmentację, klonowanie i selekcję genów kapsydu AAV za pomocą kontrolowanego trawienia DNazą I, aby umożliwić ich późniejszy ponowny montaż w sekwencje chimeryczne za pomocą dwóch reakcji PCR. W drugim kroku otrzymany produkt PCR jest klonowany z powrotem do konstrukcji AAV zdolnej do replikacji, w celu uzyskania biblioteki plazmidowej zawierającej co najmniej 1 milion różnych genów kapsydu AAV.

Następnie ta biblioteka plazmidów jest transfekowana do komórek 2 9 3 T wraz z pomocniczym plazmidem adenowirusowym w celu wytworzenia biblioteki wirusów chimerycznych, które mogą być następnie selekcjonowane na komórkach docelowych lub w organizmach zwierzęcych. Wyniki wykazują pomyślną inżynierię molekularną i ewolucję nowych syntetycznych wektorów A A V w oparciu o zwiększoną lub bardziej specyficzną ekspresję genu reporterowego w hodowlach komórkowych lub u dorosłych myszy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak prezentacja peptydów, jest fakt, że tasowanie rodzin DNA ma potencjał do jednoczesnej zmiany i ulepszenia wielu cech kapsydu AV, od wiązania się z komórkami i transportu wewnątrzkomórkowego, po rozpakowywanie i ekspresję genów w jądrze komórkowym.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach terapii genowej i wirusologii, takich jak sposób uzyskania optymalnego wektora dla danej zastosowania terapeutycznego lub sposób analizy domen kapsydu wirusowego odpowiedzialnych za określone właściwości. Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię wielu ludzkich chorób, w tym infekcji patogenami wirusowymi, ponieważ nasza metoda umożliwia ewolucję molekularną wektorów A V, które w sposób specyficzny i skuteczny infekują wirusowe komórki docelowe, takie jak limfocyty T w przypadku HIV lub hepatocyty w przypadku wirusów zapalenia wątroby. Metoda ta może zatem dostarczyć wiedzy na temat biologii A V i może być wykorzystana do ulepszania wektorów AV w terapii genowej.

Metodę tę można z łatwością zastosować również do innych rodzin genów o znaczeniu podstawowym lub aplikacyjnym, takich jak geny kodujące fluorescencję, trzy reportery, enzymy komórkowe lub białka uczestniczące w interferencji RNA. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy próbowaliśmy znaleźć odpowiedni wektor do transfuzji genów terapeutycznych do tkanek dorosłych myszy i zdaliśmy sobie sprawę, że wszystkie naturalnie występujące serotypy AV mają wady, takie jak wysoka rozpowszechnienie w populacji ludzkiej i w konsekwencji wysoka częstotliwość odpowiedzi immunologicznej lub słaba wydajność in vivo pomimo efektywnej transdukcji hepatocytów in vitro. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ fragmentacja genu kapsydu AV opartego na DNA oraz niektóre etapy produkcji biblioteki wirusowej są trudne do opanowania, gdyż wymagają doświadczenia i świadomości krytycznych etapów, aby ułatwić rutynowe przygotowanie wystarczających ilości różnych genów kapsydu wirusów towarzyszących adenowirusom.

W celu przeprowadzenia tasowania DNA geny te są początkowo subklonowane do wspólnego szkieletu plazmidowego. Aby to osiągnąć, pożądane geny cap są najpierw amplifikowane metodą PCR z powszechnie dostępnych plazmidów AAV przy użyciu starterów cap F i cap R. Następnie geny cap są klonowane do plazmidu zaprojektowanego tak, aby zawierał specyficzne miejsca wiązania starterów oraz miejsca restrykcyjne. W tym przykładzie gen cap jest klonowany do miejsc PAC one oraz SC one, które znajdują się w starterach użytych do amplifikacji cap oraz w plazmidzie biorcy, lecz nie występują w większości AAV. Po przygotowaniu zestawów plazmidów kodujących geny kapsydu AAV rozpoczyna się procedurę tasowania cap metodą PCR, amplifikując wybrane geny cap przy użyciu starterów T3 i T7.

Przygotuj 50 µL reakcji PCR zawierającej 200 ng plazmidu cap, każdy starter w końcowym stężeniu 2 µM, 10 µL buforu High Five 5x oraz 1 µL polimerazy High Five. Reakcja ta pozwoli uzyskać około 3 µg produktu PCR, co jest wystarczającą ilością do przeprowadzenia maksymalnie sześciu reakcji shufflingu, w zależności od liczby genów cap włączonych do biblioteki. Rozpocznij od 5 minut w 95 °C, a następnie przeprowadź 40 cykli obejmujących 15 sekund w 94 °C, 30 sekund w 57 °C oraz 3 minuty w 68 °C, kończąc etapem końcowym przez 10 minut w 72 °C.

Po oczyszczeniu produktów PCR przeprowadza się kontrolowane trawienie DNA w celu wytworzenia fragmentów genu cap do ponownego montażu w Kyra. Jednym z najtrudniejszych aspektów tej procedury jest uzyskanie odpowiedniego zakresu długości przetrawionych fragmentów DNA genu cap niezbędnych do ponownego montażu w kyras; w tym celu przygotowujemy początkowo duże ilości oczyszczonych genów cap, a następnie przeprowadzamy wiele równoległych reakcji w różnych warunkach. Aby ujednolicić proces trawienia, należy zmieszać różne produkty PCR genu cap do łącznej ilości 4 µg w 54 µL wody, a następnie dodać 6 µL buforu reakcyjnego DS oraz 0,5 µL DNAs one do mieszaniny; ostrożnie wymieszać zawartość probówki trzy razy, krótko odwirować i natychmiast umieścić na bloku grzewczym o temperaturze 25 °C.

Inkubuj tę pierwszą reakcję przez jedną minutę. Następnie przygotuj drugą reakcję trawienia, ale inkubuj ją w temperaturze 25 °C przez jedną minutę i 15 sekund. W ten sposób przygotuj wiele równoległych reakcji z czasami inkubacji od jednej do dwóch minut, zmieniając czas inkubacji w odstępach 15 sekund.

Zatrzymaj każdą reakcję, dodając 6 µL 25 mM EDTA. Krótko wymieszaj próbkę na wirówce typu vortex i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 75 °C. Wielokrotne reakcje równoległe pozwolą uzyskać pięć próbek białek cap trawionych przez DNAs, jedną dla różnych czasów inkubacji; oczyść fragmenty cap na standardowym żelu 1% AROS.

W idealnym przypadku, pomiędzy 100 a 500 pz powinna być widoczna smuga, jak pokazano w tym przykładzie z czasami inkubacji wynoszącymi początkowo jedną minutę, 45 sekund lub dwie minuty. W procesie DNA family shuffling fragmenty cap są najpierw składane w sekwencje pełnej długości za pomocą PCR, w którym zachodzi samopremowanie na podstawie częściowych homologii. Przygotuj 50 µL reakcji z 500 ng oczyszczonych fragmentów, 10 µL 10x buforu do fuzji, 1 µL 10 mM dNTPs, 1,5 µL DMSO oraz 0,5 µL fuzji.

Dwie polimerazy inkubuje się przez 30 sekund w temperaturze 98 °C, a następnie przeprowadza 40 cykli obejmujących 10 sekund w 98 °C, 30 sekund w 42 °C i 45 sekund w 72 °C, po czym następuje końcowy etap 10 minut w 72 °C. Następnie przeprowadza się amplifikację zrekonstruowanych genów białek cap w celu późniejszego klonowania za pomocą drugiej reakcji PCR, wykorzystując primery wiążące się z konserwowanymi sekwencjami flankującymi. Na przykład, przy użyciu par SAF i SAR lub CUF i CUR, przygotowuje się reakcję o objętości 50 µL zawierającą 2 µL produktu pierwszej reakcji PCR, każdy primer w stężeniu końcowym 2 µM, 0,5 µL chlorku magnezu, 10 µL buforu 5x high-FI oraz 1 µL polimerazy high-FI.

Zaleca się przeprowadzenie od 16 do 24 reakcji PCR, aby zapewnić wystarczająco wysoką wydajność dla późniejszego klonowania. Po połączeniu produktów PCR i oczyszczeniu pełnowymiarowego prążka cap, kolejnym krokiem jest trawienie oczyszczonej puli genów cap za pomocą PAC one i SC one w celu klonowania do plazmidu a a v zdolnego do replikacji. Plazmid biorca zawiera odwrócone powtórzenia końcowe a a v flankujące gen rep AAV two pod kontrolą promotora AAV P five, PAC one i ASC one.

Miejsca restrykcyjne poniżej rep umożliwiają klonowanie w ramce odczytania puli przetasowanych cap. Miejsca wiązania starterów LSE wskazane strzałkami są przydatne do sekwencjonowania genu cap; połącz fragmenty cap i odpowiednio przecięty szkielet plazmidu biorcy w stosunku molowym trzy do jednego. Przygotuj master mix o całkowitej objętości 40 µL, wystarczający dla 20 transformacji, z końcowym stężeniem DNA wynoszącym 15 ng/µL.

Inkubować przez noc w temperaturze 16 °C, a następnego dnia przeprowadzić transformację mieszaniny ligacji do szczepu E. coli. Wymieszać 2 µL reakcji ligacji z 30 µL elektrokompetentnych komórek E. coli i przenieść do uprzednio schłodzonych kuwet do elektroporacji na lodzie; przeprowadzić elektroporację przy wartościach 1,8 kV, 200 Ω i 25 µF. Stała czasowa powinna wynosić około 5 ms. Natychmiast dodać 1 mL podgrzanego medium SOC i przenieść do kolby o pojemności 250 ml.

20 takich elektroporacji pozwoli uzyskać bibliotekę o różnorodności około 1 × 10⁶ różnych klonów. Do połączonych transformat dodać jedną objętość uprzednio ogrzanej pożywki SOC, a następnie inkubować przy 37 °C i 180 RPM przez jedną godzinę. Następnie 40 ml połączonych transformat dodać do 800 ml pożywki lb z ampicyliną i inkubować przez kolejne 16 godzin w tych samych warunkach, po czym plazmidowy DNA biblioteki oczyścić za pomocą dostępnego komercyjnie zestawu.

Produkcja biblioteki wirusowej rozpoczyna się od transfekcji komórek HEC 2 9 3 T biblioteką a a v; aby rozpocząć tę procedurę, wysiej komórki HEC 2 9 3 T na 10 15 centymetrowych szalek kwadratowych i hoduj je przez 48 godzin w temperaturze 37 °C. Dla każdej transfekcji przygotuj dwie następujące mieszaniny odczynników w dwóch oddzielnych probówkach. Poniższe ilości podano w przeliczeniu na 10 płytek w pierwszej probówce.

Wymieszać 7,9 ml chlorku sodu i DNA, a następnie dodać wodę do uzyskania całkowitej objętości 15,8 ml. Do drugiej probówki dodać 3,52 ml polietylenoaminy, 7,9 ml chlorku sodu oraz 4,38 ml wody. Połączyć obie mieszaniny, wymieszać w wortexie i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie równomiernie rozdzielić roztwór do każdej szalki z komórkami 2 9 3 T. Inkubować w temperaturze 37 °C.

Po 48 godzinach można zebrać bibliotekę wirusową. Zeskrob komórki do medium, połącz komórki ze wszystkich naczyń w jednej probówce i wiruj przy 1200 RPM przez 15 minut. Resuspenduj osad komórkowy w sześciu mililitrach buforu do lizy, a następnie poddaj pięciu cyklom zamrażania i rozmrażania. Po pięciu cyklach zamrażania i rozmrażania inkubuj z Ben Nase przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie odwiruj szczątki komórkowe przy 3 750 RPM przez 20 minut. Przygotuj gradient do oczyszczania wirusa, używając pipety Pasteura do dodania pięciu mililitrów zawiesiny wirusa do probówki wirówkowej Beckman Quicks seal, a następnie dodaj po 1,5 mililitra roztworów jodka w stężeniach 15%, 25% i 40%. Uzupełnij gradient buforem lizującym i wiruj w ultrawirówce przy 50 000 K przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po zakończeniu ultrawirowania wyjmij probówkę z rotora i przemyj jej zewnętrzną powierzchnię 70% etanolem. Wbij igłę w górną część probówki w celu zapewnienia wentylacji, a następnie za pomocą drugiej igły pobierz 1,2 mililitra frakcji 40% IOL. Należy uważać, aby nie pobierać materiału z frakcji 25%, ponieważ jest ona pusta.

Kapsydy AAV. Poszczególne klony z oryginalnej biblioteki plazmidów są analizowane pod kątem funkcjonalności i różnorodności poprzez wykorzystanie ich do produkcji rekombinowanych wektorów AAV wykazujących ekspresję genu reporterowego. Następnie zainfekowane są hodowle komórkowe lub zwierzęta różnymi ilościami oczyszczonego wirusa i wyznaczana jest wydajność transdukcji.

Przedstawiono tutaj wyniki mikroskopii fluorescencyjnej dla trzech ludzkich linii komórkowych zainfekowanych pięcioma różnymi rekombinowanymi wektorami AAV wykazującymi ekspresję YFP, stworzonymi z przetasowanych genów cap. Alternatywną metodą analizy wydajności transdukcji jest pomiar ekspresji fluorescencyjnego genu reporterowego za pomocą cytometrii przepływowej (FACS). Rysunek ten przedstawia typowy wynik dla czterech typów komórek: ludzkich komórek nerkowych, ludzkich komórek szyjki macicy, mysich fibroblastów oraz ludzkich limfocytów T, zainfekowanych 18 różnymi rekombinowanymi wektorami AAV wykazującymi ekspresję YFP, stworzonymi z genów cap losowo wybranych z oryginalnej biblioteki.

Ekspresję YFP zakodowano kolorystycznie w celu ułatwienia wizualizacji. Przedstawione wartości to procenty przetransdukowanych komórek, gdzie kolor czarny oznacza 0%, a biały najwyższą zmierzoną wartość dla każdego klonu typu komórkowego. Kolor czerwony w przypadku klonu B2 obrazuje klon o niskiej ogólnej skuteczności, co jest spodziewane w przypadku niezmodyfikowanych kapsydów. Następnie bibliotekę wirusową można przesiewać w poszukiwaniu pojedynczych cząsteczek wykazujących większość lub wszystkie pożądane właściwości w danej linii komórkowej lub w organizmach zwierzęcych w celu przeprowadzenia selekcji.

W hodowlach komórkowych komórki są najpierw coinfekowane różnymi alikwotami biblioteki oraz wirusem ENO five w celu wsparcia wzrostu a a v, następnie komórki są zbierane, a namnożony a a v jest ekstrahowany i wykorzystywany do reinfekcji nowych komórek. Wyznaczenie optymalnych stosunków adenowirusów a a v dla coinfekcji komórek jest istotne, a dobrą miarą skutecznej infekcji arius jest wystąpienie efektów cytopatycznych trzy dni po inokulacji wirusem, objawiających się zaokrągleniem i odklejaniem się komórek; na tej rycinie lewy górny panel przedstawia komórki niezinfekowane, natomiast pozostałe panele pokazują komórki zainfekowane wskazanymi ilościami adenowirusa w przeliczeniu na cząstki na komórkę. Innym przydatnym odczytem w przypadku infekcji i amplifikacji a a v jest detekcja białek kapsydu za pomocą western blottingu z użyciem przeciwciała B one, które rozpoznaje wysoce konserwowany epitop kapsydu a a v.

Lewy blot przedstawia komórki coinfekowane różnymi objętościami w mikrolitrach biblioteki a a V oraz wirusa pomocniczego ENO. Pierwsze dwie ścieżki stanowią dobre przykłady warunków, w których ekspresja białka a a v jest ledwo wykrywalna, co wskazuje na wystarczającą, ale nie nadmierną infekcję i amplifikację a a v, a tym samym na pożądane ścisłe powiązanie genotypu z fenotypem. W związku z tym do reinfekcji świeżych komórek wykorzystano 0,11 lub 10 mikrolitrów tych supernatantów.

Wyniki analizy western blot przedstawiono w komórkach po prawej stronie. W LA c przeprowadzono zakażenie samym v jako kontrolę negatywną. Kluczowe jest również monitorowanie różnorodności biblioteki podczas powtarzanych rund zakażeń za pomocą sekwencjonowania DNA.

Ten schemat przedstawia porównanie sekwencji białek klonów AAV z biblioteki opartej na AAV 2, 8 i 9 przed i po selekcji; sekwencje powyżej czerwonej linii reprezentują rodzicielskie AAV. Fioletowe strzałki wskazują zdarzenia rekombinacji homologicznej. Czerwona strzałka oznacza crossing-over między AAV 2 a AAV 9, zaobserwowany u wszystkich wybranych klonów. W przypadku selekcji w organizmach zwierzęcych, bibliotekę AAV wprowadza się do zwierząt, a następnie odzyskuje z komórek lub tkanek docelowych za pomocą PCR, po czym ponownie klonuje i pakuje do kolejnej rundy infekcji.

Przedstawiono tutaj przykład odzyskania pomyślnie zainfekowanych klonów AAV z wątrób myszy tydzień po obwodowej infuzji biblioteki. Ścieżka pierwsza pokazuje oczekiwany prążek o wielkości 2,2 kilobazy, natomiast ścieżka druga to kontrola bez matrycy; wielkości prążków markera DNA na ścieżce M podano w kilobazach. Niezależnie od procedury selekcji, wzbogacone warianty kapsydu muszą zostać ostatecznie zwalidowane w odpowiednich systemach.

Tutaj przedstawiono przykład wyższej wydajności wzbogaconej chymerzy AAV w hodowlach komórkowych. Ciemniejsze kolory wskazują na wyższą zakaźność w przeliczeniu na liczbę cząsteczek, a zatem klona. AAV-DJ wykazuje lepsze parametry niż zbiór ośmiu naturalnych typów dzikich AAV w szerokim zakresie linii komórkowych.

Na koniec przedstawiono analizę wybranego klonu AAV KYMERA w wątrobie myszy. AAV DN wyselekcjonowano na komórkach hepatoma i następnie wykorzystano do produkcji rekombinowanych wektorów wyrażających lucyferazę, co pokazano na reprezentatywnych myszach (trzy na grupę) tydzień po obwodowej infuzji równych dawek tego wektora lub kontroli opartej na dzikim typie AAV8, jednym z najsilniejszych znanych naturalnych izolatów w wątrobie myszy. Należy zauważyć, że choć klon AAV DN daje nieco niższą całkowitą ekspresję w wątrobie, jest on bardziej specyficzny dla tego organu, ponieważ wykazuje znacznie mniejszą ekspresję poza celem w tkankach niehepatycznych po dostosowaniu poziomów ekspresji w wątrobie za pomocą oprogramowania do obrazowania.

Przy prawidłowym wykonaniu technika ta może zostać zrealizowana w ciągu jednego tygodnia, począwszy od amplifikacji genów kapsydu AV, a kończąc na uzyskaniu biblioteki wirusowej. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że przedstawiony tutaj protokół został opracowany na podstawie naszych doświadczeń z selekcją naturalnych serotypów AV i jest wysoce prawdopodobne, że niektóre warunki będą wymagały dostosowania i precyzyjnego dostrojenia przez innych użytkowników tworzących własne biblioteki customowe. Poza tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak prezentacja peptydów z ukierunkowaną mutagenezą przy użyciu AGENESIS lub randomizacja oparta na PCR, aby wygenerować biblioteki o wysokiej różnorodności lub podjąć próbę dalszej poprawy właściwości kapsydów, które zostały stworzone i wzbogacone za pomocą DNA family shuffling po ich opracowaniu.

Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie wirusowej dostawy genów do eksplorowania strategii terapeutycznych w chorobach i powiązanych komórkach docelowych, w których konwencjonalne typy AAV dawały niezadowalające wyniki, takich jak zakażenie HIV i limfocyty T, a także do badania wektorowego transferu genów do ludzkich komórek macierzystych i innych trudnych do zainfekowania komórek w hodowli. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak projektować i ewoluować wysoce zróżnicowane biblioteki syntetycznych wektorów wirusów towarzyszących adenowirusom, wykorzystując kombinację fragmentacji i ponownego składania genów, a także jak przeprowadzać selekcję tych bibliotek w komórkach hodowlanych lub u zwierząt w celu wzbogacenia poszczególnych kapsydów o pożądane, specyficzne właściwości do zastosowania jako wektory transferu genów. Należy pamiętać, że praca z adenowirusami może być niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy podjąć wiele środków ostrożności.