Wyodrębnianie jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA oraz RNA z środowiskowej populacji wirusów z wykorzystaniem chromatografii na hydroksyapatycie
29 września 2011
Opisujemy wydajną metodę oddzielania jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA oraz cząsteczek RNA z wirusowych społeczności środowiskowych. Kwasy nukleinowe są frakcjonowane przy użyciu chromatografii na hydroksyapatycie z zastosowaniem rosnących stężeń buforów zawierających fosforany. Metoda ta umożliwia izolację wszystkich typów wirusowych kwasów nukleinowych z próbek środowiskowych.
Niniejszy materiał wideo prezentuje procedurę rozdzielania mieszanych zespołów wirusowych na podstawie składu ich kwasów nukleinianowych. Umożliwia to badanie różnorodności taksonomicznej oraz potencjału funkcjonalnego złożonych zespołów wirusowych. W procesie rozdzielania kwasów nukleinianowych zastosowano hydroksyapatyt, krystaliczną formę fosforanu wapnia.
W pierwszej kolejności przygotowuje się i równoważy kolumnę z hydroksyapatytem, a następnie nanosi na nią oczyszczone kwasy nukleinowe wirusów; oddziaływanie elektrostatyczne między dodatnio naładowanymi jonami wapnia hydroksyapatytu a ujemnie naładowanym szkieletem fosforanowym poszczególnych podtypów kwasów nukleinowych wiąże je z wypełnieniem kolumny. Następnie jednoniciowy DNA/RNA oraz dwuniciowy DNA są sekwencyjnie eluowane przy użyciu buforu fosforanowego o różnych stężeniach. Otrzymane kwasy nukleinowe są następnie odsalane i zagęszczane w celu przygotowania do wizualizacji, kwantyfikacji i identyfikacji za pomocą sekwencjonowania DNA; elektroforeza w żelu agarozowym potwierdza, że gatunki kwasów nukleinowych mogą zostać rozdzielone przy przenoszeniu (carryover) poniżej 9%.
W ten sposób metoda ta umożliwia ocenę różnorodności i potencjału funkcjonalnego społeczności wirusowych. Witam, nazywam się Doug Fro i jestem pracownikiem naukowym w laboratorium dr Shannon Williamson w j Craig Venture Institute. Dzisiaj zaprezentuję Państwu procedurę oddzielania jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA oraz RNA z środowiskowego zbioru wirusów.
Metoda ta posiada zalety względem istniejących metod, takich jak obróbka jądra komórkowego, która celuje albo w DNA, albo w RNA. Chromatografia na hydroksyapatycie umożliwia wychwycenie całej populacji wirusów. Metoda ta pozwala nam odpowiedzieć na kilka pytań w dziedzinie ekologii wirusów.
Na przykład, jaki jest całkowity zestaw genów lub różnorodność społeczności wirusowej? Po raz pierwszy pomyśleliśmy o tej metodzie, gdy chcieliśmy zbadać całe zgromadzenia planktonu z zatoki Chesapeake, nie poświęcając przy tym części sygnatury genetycznej. Roztwory niezbędne do tego eksperymentu należy przygotować wcześniej zgodnie z instrukcjami zawartymi w towarzyszącym protokole pisemnym; obejmują one bufor fosforanowy 0,12 M, bufor fosforanowy 0,20 M, bufor fosforanowy 0,40 M oraz roztwór fosforanowy 1 M.
Wszystkie roztwory przy pH 6.8 oraz hydratyzowany hydroksyapatyt w dniu eksperymentu należy poddać równoważeniu, umieszczając je w kąpieli wodnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza. Procedurę należy rozpocząć od przygotowania kolumny econo, która posłuży do separacji kwasów nukleinowych wirusa. Do końca kolumny econo należy przymocować kurek i upewnić się, że jest on zamknięty.
Za pomocą pipety należy dodać wodę dejonizowaną do kolumny, następnie nałożyć korek na górną część kolumny i kilkakrotnie ją odwrócić, aby ją przepłukać. Wodę należy odlać i powtórzyć ten proces mycia kilka razy. Następnie należy wyjąć kurek z kolumny econ i wysterylizować go w autoklawie.
Kurek nie może być autoklawowany, ponieważ by stopił się pod wpływem temperatury. Przepłucz kurek wodą zjonizowaną, a następnie ponownie 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia po zakończeniu autoklawowania. Zamontuj kurek i zamknij go.
Następnie, pracując pod wyciągiem, należy dodać jeden mililitr sigma coat do kolumny i pokryć szkło kolumny, odwracając ją ruchem obrotowym, jak pokazano tutaj. Pokrycie powierzchni sigma coat zminimalizuje przyleganie kwasów nukleinowych do powierzchni szkła. Podczas rozdziału wszystkie powierzchnie szklane zostały pokryte.
Otwórz kurek i zlej zawartość do probówki stożkowej. Następnie, aby podłączyć kolumnę do cyrkulacyjnej łaźni wodnej, użyj dwóch zacisków, aby przymocować kolumnę do statywu. Podłącz rurki silikonowe z cyrkulacyjnej łaźni wodnej w taki sposób, aby przepływ wody z łaźni odbywał się od dołu do góry.
Ustaw temperaturę na 60 °C i uruchom cyrkulację. W praktyce kolumna oraz przewody powinny zostać owinięte materiałem izolacyjnym, takim jak folia aluminiowa lub piankowa izolacja rur. Aby zminimalizować utratę ciepła, etap ten nie został tutaj przedstawiony.
Aby lepiej zobrazować procedurę, należy zamknąć kranik. Za pomocą pipety dodać 10 mililitrów sterylnej wody wolnej od RNazy. Otworzyć kranik i pozwolić wodzie spłynąć.
Następnie należy ponownie przeprowadzić mycie zgodnie z procedurą drugiego mycia. Płukanie należy powtórzyć dwukrotnie, używając 10 ml sterylnego, wolnego od RNA buforu fosforanowego 0,12 M, odlewając ciecz pomiędzy kolejnymi płukaniami. Kolumna jest teraz gotowa do chromatografii na hydroksyapatycie.
Upewnij się, że kurek stopowy kolumny econ jest zamknięty. Następnie, używając sterylnej pipety serologicznej o pojemności 2 mL, powoli dodaj 2 mL przygotowanej resuspensji rehydratyzowanej hydroksyapatyty na dno kolumny. Nałóż z powrotem zakrętkę kolumny.
Pozostawć hydroksyapatyt do osadzenia pod wpływem grawitacji przez 30 minut. Ta metoda wymaga dbałości o szczegóły. Kolumna z hydroksyapatytem pracuje z szybkością od 0,25 do 0,5 ml na minutę.
Należy zatem uważnie obserwować kolumnę, aby nie dopuścić do jej wyschnięcia. Po upływie 30 minut należy otworzyć kurek, aby spuścić bufor do pojemnika na odpady. Następnie należy zamknąć kurek i odrzucić frakcję przepływową.
Połącz kwasy nukleinowe z 0,12 M buforem fosforanowym do uzyskania końcowej objętości 500 µL i inkubuj w temperaturze 60 °C przez 10 minut. Pozwoli to na wyrównanie temperatury kwasów nukleinowych do temperatury kolumny i usprawni rozdział poszczególnych gatunków kwasów nukleinowych poprzez usunięcie ewentualnych struktur drugorzędowych. Za pomocą pipety seryjnej o pojemności 2 mL szybko nanieś roztwór kwasów nukleinowych na hydroksyapatyt, dbając o to, aby nie naruszyć kolumny.
Po przepływie całej objętości 500 µL na kolumnę, na jej górę można dodać niewielką ilość 0,12 M buforu fosforanowego, aby zapobiec wysychaniu. Pozostawić kwasy nukleinowe do związania z hydroksyapatytem na 30 minut. Po inkubacji wiązania umieścić probówkę stożkową o pojemności 15 mL pod kolumną.
Następnie otwórz kurek i pobierz początkową próbkę o objętości 500 µL, która zawiera jednoniciowy DNA. Po pobraniu 500 µL zamknij kurek. Następnie dodaj sześć mililitrów buforu fosforanowego o stężeniu 0,12 M do hydroksyapatytu, dbając o to, aby nie naruszyć kolumny.
Następnie otwórz kurek i kontynuuj zbieranie przelywu zawierającego jednoniciowy DNA do tej samej probówki o pojemności 15 mililitrów, co w poprzednim kroku. Po zebraniu około sześciu mililitrów zamknij kurek. Do probówki dodaj objętość roztworu fenol-chloroform-alkohol izoamylowy równą objętości próbki, wymieszaj energicznie za pomocą wortexa, a następnie wiruj przy 3 500 ×g przez 15 minut.
Po wirowaniu w probówce powstaną dwie warstwy. Przenieś górną warstwę wodną, zawierającą jednoniciowy DNA, do nowej probówki o objętości 15 ml i przechowuj próbkę w temperaturze pokojowej. Aby eluować i oczyścić RNA z kolumny, dodaj 6 ml 0,20 M buforu fosforanowego i zbierz filtraty do nowej probówki o objętości 15 ml. Następnie przeprowadź ekstrakcję fenolo-chloroformową.
W przypadku próbki jednoniciowego DNA powtórz ten proces, używając sześciu mililitrów 0,40 M buforu fosforanowego w celu elucji i oczyszczenia dwuniciowego DNA z kolumny. Na koniec, aby usunąć z kolumny wszelkie pozostałości dwuniciowego DNA, powtórz ten proces jeszcze raz.
Tym razem użyj sześciu mililitrów 1,00 M buforu fosforanowego do odsolenia próbek kwasów nukleinowych. Przenieś od czterech do pięciu mililitrów każdej próbki do urządzenia do filtrowania odwirówkowego Ultra 4 z membraną ultrafiltracyjną o progu odcięcia 30 000 Da. Skoncentruj próbkę do objętości poniżej 500 µL, wirując z prędkością 6 000 ×g w temperaturze 30 °C przez około pięć minut w rotorze z kątem stałym. Po odlaniu filtratu dodaj pozostałą część próbek do filtra.
Dopełnić objętość do 4–5 ml za pomocą beznukleazowego buforu 1X TE. Następnie ponownie wirować do uzyskania zagęszczonej objętości. Około pięć minut po wirowaniu dodać 4–5 ml beznukleazowego buforu 1X TE do filtra i zagęścić.
Powtórz ten etap płukania jeszcze pięć razy, aby całkowicie odsolić próbki kwasów nukleinowych. Gdy próbki zostaną całkowicie zagęszczone i odsolone, przenieś pozostałe kwasy nukleinowe do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml. Wytrąć kwasy nukleinowe, dodając 1/10 objętości octanu sodu, dwie objętości 100% etanolu oraz 1 µL GlycoBlue, a następnie wymieszaj dokładnie za pomocą vortexa i odwiruj w wirówce.
28 000 g w temperaturze 4°C przez 60 minut w wirówce. Należy uważać, aby nie zresuspenderować osadu.
Dodaj 300 µL 70% etanolu i wiruj przy 28 000 ×g w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie osusz i resuspenduj każdą frakcję w odpowiedniej objętości buforu TE dla RNA. Równe stężenia kwasów nukleinowych wirusów M13 MP18 (jednoniciowe DNA), MS2 (jednoniciowe RNA), Φ6 (dwuniciowe RNA) oraz lambda (dwuniciowe DNA) zostały połączone, a następnie rozdzielone przy użyciu chromatografii na hydroksyapatycie, co pokazano w tym filmie. Równe stężenia jednoniciowego DNA M13 MP18, jednoniciowego RNA MS2, dwuniciowego RNA Φ6 oraz dwuniciowego DNA Lambda zostały połączone, co przedstawiono w ścieżce 6, i naniesione na kolumnę z hydroksyapatytem, jak widać tutaj.
Jednoniciowy DNA/RNA oraz dwuniciowy DNA zostały niezależnie wymyte z kolumny z hydroksyapatytem przy użyciu buforu fosforanowego o stężeniach 0,12 M, 0,18 M, 0,40 M i 1,00 M. Do potwierdzenia wielkości genomów użyto drabinki 1 KB. Wyniki te wskazują, że metoda ta może być skutecznie stosowana do rozdzielania jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA oraz RNA, przy przenoszeniu mniej niż 9% materiału z jednej frakcji do kolejnej.
Metodę tę zastosowano również do rozdzielenia kwasów nukleinowych wyizolowanych ze społeczności wirusów w Zatoce Chesapeake, co przedstawiono tutaj. Jednoniciowe DNA/RNA oraz dwuniciowe DNA były niezależnie eluowane przy użyciu stężeń buforu fosforanowego odpowiednio 0,12 M, 0,20 M i 0,40 M lub 1,00 M; w pierwszej ścieżce użyto drabinki DNA o wysokiej masie, a w drugiej drabinki 1 KB, aby wizualnie potwierdzić przybliżoną masę cząsteczkową i masę kwasów nukleinowych, co widać tutaj; dwuniciowe DNA było dominującym typem kwasów nukleinowych wyekstrahowanych z wirio-planktonu z Zatoki Chesapeake. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak rozdzielać kwasy nukleinowe z mieszanego zespołu wirusowego przy użyciu chromatografii na hydroksyapatycie.
Obejmuje to przygotowanie kolumny z hydroksyapatytem oraz kwasów nukleinowych, rozdzielenie i elucję kwasów nukleinowych przy użyciu różnych stężeń buforu fosforanowego i odsolenie, a także zagęszczanie kwasów nukleinowych po rozdzieleniu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę oddzielania jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA oraz RNA z środowiskowych populacji wirusów z wykorzystaniem chromatografii na hydroksyapatycie. Technika ta umożliwia izolację różnych typów kwasów nukleinowych wirusów, co ułatwia dalsze badanie różnorodności i funkcjonalności wirusów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wirusologia
- Biologia molekularna
- Nauki o środowisku
Wstęp
- Środowiskowe społeczności wirusowe są złożone i różnorodne.
- Zrozumienie kwasów nukleinowych wirusów jest kluczowe dla badania ich roli w ekosystemach.
- Tradycyjne metody mogą nie oddzielać skutecznie różnych typów kwasów nukleinowych.
- Chromatografia na hydroksyapatycie oferuje obiecujące rozwiązanie dla tego procesu separacji.
Cel badania
- Opracowanie wydajnej metody izolacji kwasów nukleinowych wirusów.
- Pogłębienie wiedzy na temat różnorodności taksonomicznej wirusów.
- Przygotowanie kwasów nukleinowych do dalszych analiz, w tym sekwencjonowania.
Zastosowane metody
- Do rozdziału kwasów nukleinowych zastosowano chromatografię na hydroksyapatycie.
- Kolumnę wypełniono i równoważono za pomocą buforów fosforanowych.
- Kwasy nukleinowe naniesiono na kolumnę, a następnie sekwencyjnie eluowano.
- Do potwierdzenia wydajności rozdziału wykorzystano elektroforezę.
Główne wyniki
- Jednoniciowy DNA, dwuniciowy DNA oraz RNA zostały pomyślnie rozdzielone.
- Zaobserwowano zanieczyszczenie przeniesione (carryover) kwasów nukleinowych na poziomie poniżej 9%.
- Metoda ta umożliwia efektywną wizualizację i kwantyfikację kwasów nukleinowych.
- Wyniki wspierają badanie zgromadzeń wirusowych w próbkach środowiskowych.
Wnioski
- Metoda chromatografii na hydroksyapatycie jest skuteczna w rozdziale kwasów nukleinowych.
- Technika ta może ułatwić badanie różnorodności i funkcjonalności wirusów.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie w celu szerszego zastosowania w wirusologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Oddzielenie subtypów kwasów nukleinowych z mieszanych zespołów wirusowych umożliwia kompleksową charakterystykę różnorodności wirusowej bez utraty sygnatur genetycznych, co wspiera walidację celów w procesie odkrywania leków przeciwwirusowych. Chromatografia na hydroksyapatycie zapewnia skalowalną i powtarzalną metodę izolacji wirusów ssDNA, dsDNA oraz RNA do dalszego sekwencjonowania i testów funkcjonalnych. Podejście to zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną we wczesnej fazie odkrywania, umożliwiając równoległą ocenę wszystkich typów genomów wirusowych w próbkach środowiskowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dla wszystkich typów genomów wirusowych w złożonych zgromadzeniach.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez zachowanie sygnatur wirusowych ssDNA, dsDNA i RNA w celu równoległego przesiewania celów.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia triaż portfela poprzez dostarczenie ilościowych wydajności kwasów nukleinowych dla każdego podtypu przed identyfikacją wiodących kandydatów.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie standaryzowanych, frakcjonowanych pul wirusowych kwasów nukleinowych do opracowywania testów przeciwko różnorodnym celom wirusowym.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie gotowości testów poprzez powtarzalną separację z przeniesieniem poniżej 9%, co umożliwia niezawodny screening związków.
- Skalowalność: Wsparcie dla ponownego wykorzystania platformy w przypadku wielu próbek z populacji wirusowych przy spójnych profilach elucji z wykorzystaniem określonych gradientów buforu fosforanowego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Zapewnia ciągłość procesu od środowiskowego pobierania próbek wirusowych do walidacji przedklinicznej poprzez zachowanie specyficznych dla genotypu kwasów nukleinowych.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia ocenę potencjału funkcjonalnego wirusów ssDNA, dsDNA i RNA w celu właściwego doboru modelu przedklinicznego.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczanie specyficznej dla podtypu kwantyfikacji w celu dopasowania biomarkerów w badaniach translacyjnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów badawczych, umożliwiając frakcjonowanie kwasów nukleinowych wirusów przed sekwencjonowaniem, opracowaniem testów i screeningiem funkcjonalnym, co wspiera kampanie identyfikacji wiodących związków.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez izolację wirusów ssDNA, dsDNA i RNA w celu niezależnej analizy funkcjonalnej.
- Przesiewanie: Dostarcza frakcje kwasów nukleinowych gotowe do analizy, charakteryzujące się wysoką czystością i niskim poziomem zanieczyszczeń, co umożliwia niezawodne przesiewanie wysokoprzepustowe.
- Analityka: Zapewnia ilościowe wydajności kwasów nukleinowych oraz profile elektroforetyczne, które pozwalają na porównanie wyników w różnych warunkach i punktach czasowych.
- Badania translacyjne: Łączy próbkowanie środowiskowe z ciągłością przedkliniczną dzięki zachowaniu integralności kwasów nukleinowych dla późniejszej walidacji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę frakcjonowania z możliwością ponownego wykorzystania, którą można zastosować do różnorodnych zgromadzeń wirusowych w wielu projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celu dzięki kompleksowej reprezentacji genomu wirusowego.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność separacji kwasów nukleinowych pomiędzy laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zredukowane biologiczne ryzyko na późnych etapach programów przeciwwirusowych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje dotyczące rozwoju oparte na pełnych profilach różnorodności wirusowej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie obchodzenia się z kwasami nukleinowymi oraz technik chromatograficznych.
- Zależność od systemów kompatybilnych z HPLC oraz infrastruktury do zbierania frakcji.
- Konieczność standaryzacji przygotowania buforu fosforanowego i kontroli temperatury na poziomie 60°C.
- Konieczność uwzględnienia adaptacji do zmiennego ładunku wirusowego i złożoności próbek pochodzących ze źródeł środowiskowych.
- Ograniczenie praktyczne: etapy równoważenia kolumny i wiązania wymagają precyzyjnego przestrzegania ram czasowych, aby zapobiec degradacji lub utracie kwasów nukleinowych.
