Pomiar aktywności czynnika V w ludzkiej plazmie przy użyciu mikropłytkowego testu krzepliwości

Ogólnym celem poniższej procedury było opracowanie testu na mikropłytkach pozwalającego na pomiar aktywności białka krzepnięcia – czynnika V – podczas formowania się skrzepu fibrynowego w ludzkiej plazmie. W odpowiedzi na uraz aktywowany jest proces krzepnięcia krwi, który prowadzi do serii reakcji konwersji zymogenów w proteazy, co w efekcie skutkuje powstaniem enzymu krzepnięcia – trombiny; trombina rozszczepia rozpuszczalny fibrynogen do monomerów fibryny, które następnie łączą się, tworząc nierozpuszczalny skrzep fibrynowy. W stanie zdrowia lub braku urazu krew pozostaje swobodnie płynną cieczą, a ilość powstałej fibryny jest równa ilości fibryny degradowanej lub rozkładanej.

Jednakże w pewnych stanach chorobowych nadmierne krzepnięcie prowadzi do chorób serca i udarów, podczas gdy zbyt słabe krzepnięcie prowadzi do skłonności do krwawień, co jest często obserwowane w hemofiliach. Czynnik V jest białkiem osocza, którego aktywowana forma, czynnik VA, stanowi kluczowy akcelerator generowania trombiny podczas tworzenia skrzepu fibrynowego jako część kompleksu enzymatycznego protrombiny; protrombinaza składa się z czterech komponentów: czynnika XA (proteazy), kofaktora czynnika VA, lipidowej powierzchni oraz wapnia. Czynnik VA zwiększa wydajność katalityczną lub kcat czynnika XA względem jego substratu, protrombiny, około 3000-krotnie, w ten sposób znacząco nasilając generowanie trombiny i tworzenie skrzepu fibrynowego.

Platforma mikropłytek jest preferowana do pomiaru zdarzeń katalizowanych enzymatycznie ze względu na wygodę, koszt czasowy, małe objętości próbek, możliwość ciągłego monitorowania oraz wysoką przepustowość. Proces tworzenia się skrzepu fibryny można monitorować za pomocą czytnika mikropłytek, mierząc wzrost absorbancji światła plazmy w miarę jak zmienia ona swój wygląd z przejrzystego żółtego (brak skrzepu fibryny i minimalna absorbancja światła) na nieprzezroczysty i mętny (obecność skrzepu fibryny i maksymalna absorbancja światła). Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ręczne testy w probówkach przechylanych lub analizy z użyciem analizatorów automatycznych, są szybkość, niski koszt, niewielkie wymagania co do objętości próbki oraz wysoka przepustowość.

Test ten mierzy aktywność nieumyślnie aktywowanego oraz aktywowanego trombiną czynnika V, aby uzyskać pełną ocenę ilościową jego całkowitej aktywności funkcjonalnej. Technikę tę zaprezentuje Derek Tilley, student studiów magisterskich w laboratorium. Aby zmierzyć aktywność czynnika V w próbce osocza, konieczne jest sporządzenie jednofazowych krzywych wzorcowych aktywności czynnika V dla czasu tworzenia skrzepu fibrynowego w panelu A oraz początkowej szybkości tworzenia skrzepu fibrynowego w panelu B, wykorzystując jako standard normalne ludzkie osocze (NHP), które z definicji zawiera jedną jednostkę aktywności czynnika V na mL. Odmrozić osocze z niedoborem czynnika V, normalne ludzkie osocze, nieznane próbki osocza oraz tromboplastynę w temperaturze 37 °C przez 10 minut.

Delikatnie wymieszać plazmę z niedoborem czynnika V, przenieść do oddzielnych plastikowych tacek do mycia i inkubować w lodzie. Normalną plazmę ludzką oraz nieznane próbki plazmy przechowywać w lodzie po delikatnym wymieszaniu. Chlorek wapnia 25 mM w wodzie destylowanej przechowywać w oddzielnej taccce do mycia w temperaturze pokojowej w celu sporządzenia standardowych krzywych aktywności jednofazowej czynnika V.

Przygotować po 200 µL dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych normalnej ludzkiej plazmy w zakresach 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 oraz 512 krotnych w buforze HBS pH 7.4, używając probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml; dokładnie wymieszać na wirówce typu vortex i inkubować w lodzie. Dla nieznanych próbek plazmy przygotować po 200 µL 40-krotnych rozcieńczeń normalnej ludzkiej plazmy oraz plazmy z nieznanych próbek w buforze HBS pH 7.4, używając probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Umieścić pięć pasków z mikropłytkami w uchwycie szablonowym czytnika mikropłytek.

Włącz czytnik mikropłytek i uruchom oprogramowanie aplikacyjne Softmax Pro do mikropłytek. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj jednocześnie 50 µL plazmy z niedoborem czynnika V do wszystkich dołków mikropłytki z próbkami. Za pomocą pojedynczej pipety dodaj 50 µL przygotowanych 10 rozcieńczeń seryjnych normalnej ludzkiej plazmy, 40-krotnych rozcieńczeń normalnej ludzkiej plazmy oraz nieznanych próbek plazmy do oddzielnych dołków mikropłytki. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 50 µL tromboplastyny do wszystkich dołków z próbkami. Inkubuj w czytniku mikropłytek w temperaturze 25 °C przez jedną minutę, z wstrząsaniem przez okres od 15 do 25 sekund podczas tej minutowej inkubacji.

Korzystając z komputera połączonego z czytnikiem mikropłytek, uruchom oprogramowanie Softmax Pro Microplate. Ustaw czytnik mikropłytek na tryb pomiaru absorbancji przy długości fali 405 nm, temperaturę kinetyczną na 25 °C oraz zaprogramuj czytnik tak, aby wstrząsał płytką przez pierwsze pięć sekund po dodaniu chlorku wapnia i mierzył absorbancję przy 405 nm co pięć sekund przez sześć minut. Następnie, pięciosekundowy interwał wstrząsania nie jest uwzględniany w obliczaniu czasu krzepnięcia. Używając jednocześnie dwóch pipet wielokanałowych, dodaj 50 µL chlorku wapnia do dwóch pasków mikropłytki z próbkami.

Odczekaj 15 sekund i niezwłocznie naciśnij ikonę start w programie Softmax Pro na komputerze, aby rozpocząć analizę. Dla każdej analizowanej próbki osocza wyznaczany jest czas tworzenia skrzepu, który definiuje się jako czas w sekundach do osiągnięcia połowy maksymalnego wzrostu absorbancji. Początkowa szybkość tworzenia skrzepu jest definiowana jako szybkość wzrostu absorbancji w ciągu pierwszych pięciu punktów czasowych liniowej części wzrostu absorbancji w funkcji czasu.

Zakres tworzenia skrzepu definiuje się jako różnicę między maksymalną a minimalną absorbancją osiągniętą podczas procesu krzepnięcia na koniec pomiaru. Należy wykorzystać profile ABSORBANCJI w funkcji czasu w programie Softmax Pro, aby wyznaczyć czas, szybkość początkową oraz zakres tworzenia skrzepu dla rozcieńczeń seryjnych normalnej ludzkiej plazmy. W celu sporządzenia krzywych wzorcowych dla aktywności czynnika V w metodzie jednostopniowej należy wykorzystać czasy krzepnięcia dla 40-krotnie rozcieńczonej normalnej ludzkiej plazmy oraz nieznanych próbek plazmy, aby zinterpolować aktywność czynnika V w jednostkach na ml z krzywej wzorcowej aktywności czynnika V w metodzie jednostopniowej.

Reprezentuje to aktywność czynnika V w jednym etapie lub bez celowej aktywacji trombiną. Jest to reprezentatywny przykład tworzenia się skrzepu fibryny w teście czynnika V w czasie, wygenerowany przez czytnik mikropłytek. Profil przedstawia tworzenie się skrzepu fibryny z użyciem normalnej ludzkiej plazmy rozcieńczonej 32-krotnie na pojedynczej mikropłytce.

Oś pionowa oznacza zmianę absorbancji przy 405 nanometrach, która wystąpiła w wyniku tworzenia się skrzepu fibryny. Czas tworzenia skrzepu obliczono jako punkt środkowy krzywej absorbancji w funkcji czasu, wynoszący 36,4 sekundy. Początkowe tempo tworzenia skrzepu obliczono na 611,88 mU/min.

Zakres tworzenia się zmętnienia obliczono na 0,35 jednostek. Test czynnika V precyzyjnie mierzy początkową szybkość oraz zakres tworzenia się zmętnienia. Inspekcja dołków po zakończeniu testu potwierdziła wystąpienie krzepnięcia.

We wszystkich reakcjach osiągnięto zbliżony stopień krzepnięcia, przy ogólnej zmianie absorbancji przy 405 nanometrach wynoszącej od 0,35 do 0,45 jednostki pomiędzy absorbancją początkową a maksymalną absorbancją po dodaniu tromboplastyny i chlorku wapnia. Reprezentatywne przykłady jednofazowej aktywności czynnika V, krzywa wzorcowa czasu krzepnięcia w sekundach w funkcji aktywności czynnika V w jednostkach na ml oraz początkowa szybkość krzepnięcia w milijednostkach na minutę w funkcji aktywności czynnika V w jednostkach na ml dla prawidłowej ludzkiej plazmy są przedstawione odpowiednio na panelu A i panelu B.

Ponieważ czynnik V jest normalnie aktywowany przez trombinę, aktywny kofaktor czynnik Va wymaga przeprowadzenia drugiego testu po dodaniu trombiny i inkubacji, co jest kluczowe dla dokładnego pomiaru dwuetapowej aktywności czynnika V w próbce osocza poprzez celową aktywację dodaną trombiną. Do dwuetapowego testu czynnika V przygotować od 200 do 300 µL oczyszczonej trombiny o stężeniu końcowym 100 nM w buforze HBS pH 7.4 i inkubować w lodzie. Następnie 120 µL normalnego ludzkiego osocza oraz osocza z próbek rozcieńczyć od 40 do 100 razy, dodając 170 µL buforu HBS pH 7.4 zawierającego 2.8 mM.

Chlorek wapnia. Do każdej próbki należy dodać 10 µL trombiny, aby uzyskać stężenie końcowe 10 nM. Wymieszać za pomocą wirówki vortex i inkubować w temperaturze 37 °C przez jedną minutę, a następnie rozcieńczyć normalną plazmę ludzką oraz plazmy z próbek 500-krotnie, dodając 400 µL buforu HBS pH 7,4.

Wyznacz czas krzepnięcia dla prawidłowej ludzkiej plazmy w każdym z testów próbek plazmy nieznanych na podstawie profili absorbancji w funkcji czasu w programie SoftMax Pro. Uwzględniając 500-krotne rozcieńczenie, wykorzystaj czas krzepnięcia dla każdej próbki do obliczenia dwuetapowej aktywności czynnika V na podstawie jednowypałowej krzywej standardowej czasu krzepnięcia w funkcji aktywności czynnika V. Reprezentuje to dwuetapową aktywność czynnika V lub aktywność z celową aktywacją trombiną.

Całkowitą aktywność czynnika V można następnie obliczyć jako różnicę między aktywnością czynnika V w metodzie dwuetapowej a aktywnością czynnika V w metodzie jednoetapowej. Do pomiaru aktywności czynnika V w normalnej ludzkiej plazmie oraz w plazmie od dziewięciu pacjentów z rozsianym krzepnięciem wewnątrznaczyniowym (DIC) wykorzystano krzywą wzorcową zależności logarytmu czasu krzepnięcia od logarytmu aktywności czynnika V. U wszystkich dziewięciu pacjentów z DIC stwierdzono, że aktywność czynnika V w metodzie jednoetapowej oraz początkowe szybkości tworzenia skrzepu były średnio obniżone o 54% i 18%. Aktywność czynnika V w metodzie dwuetapowej oraz aktywność całkowita były u pacjentów z DIC średnio niższe o 44% i 42% w porównaniu do normalnej ludzkiej plazmy.

W przypadku czynnika V oraz pacjentów z DIC odnotowano wydłużenie czasu i zmniejszenie szybkości tworzenia skrzepu włóknistego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne wyobrażenie o tym, jak wdrożyć tę metodę w swoim laboratorium. Metodę tę można łatwo dostosować do pomiaru aktywności dowolnego czynnika krzepnięcia w osoczu, co czyni ją odpowiednią dla szerokiego zakresu zastosowań badawczych i klinicznych.

W ostateczności informacje te dotyczące czynnika V wpłyną pozytywnie na opiekę zdrowotną poprzez wcześniejszą diagnostykę i leczenie zaburzeń zakrzepowych lub krwotocznych, takich jak DIC.