Prosta i skuteczna metoda wykrywania aktywacji czynnika jądrowego w ludzkich neutrofilach za pomocą cytometrii przepływowej

W eksperymencie wykorzystano cytometrię przepływową do wykrywania i ilościowego oznaczania białek jądrowych w izolowanych i znakowanych immunologicznie jądrach neutrofili w celu oczyszczenia neutrofili z ludzkiej krwi obwodowej. Usunąć czerwone krwinki za pomocą dekstryny, a następnie odwirować osocze w gradiencie gęstości. Następnie za pomocą przeciwciał przeciwreceptorowych stymuluj oczyszczone neutrofile za pomocą integryn lub receptorów FC.

Przystąp do izolowania jąder i utrwalaj próbki do znakowania immunologicznego specyficznymi przeciwciałami przeciwko interesującemu czynnikowi jądrowemu NU. Na przykład NF kappa B ostatecznie analizuje jądra za pomocą cytometrii przepływowej w celu wykrycia niewielkich zmian w aktywacji czynnika jądrowego. Uzyskano wyniki, które pokazują, że stymulacja neutrofili poprzez ich integryny prowadzi do wzrostu stężenia jądrowego czynnika transkrypcyjnego N kappa B Szlaki sygnałowe, które prowadzą do aktywacji czynnika jądrowego, są zwykle badane za pomocą testów genów reporterowych lub testów przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej w komórkach pierwotnych.

Często te metody nie są odpowiednie. Cytometria przepływowa umożliwia szybkie wykrywanie i kwantyfikację białek jądrowych w izolowanych jądrach. Zacznij od 10 mililitrów świeżo pobranej krwi od zdrowych dorosłych ochotników.

Odpipetować dwa mililitry 6% roztworu dekstryny T 500 do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów. Następnie dodaj 10 mililitrów krwi zmieszanej przez odwrócenie probówki dwa lub trzy razy i odczekaj 45 minut na grawitacyjną sedymentację erytrocytów w świeżej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 mililitrów. Umieść pięć mililitrów opakowania FI fial.

Zbierz osocze bogate w leukocyty, które utworzyło się nad osadzonymi erytrocytami. Ostrożnie ułóż go na wierzchu opakowania fial, aby utworzyć dwie fazy, odwirować w temperaturze 516 g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant i rozbić osad komórkowy, stukając rurką o stojak.

Następnie ponownie zawieś ogniwa w 10 mililitrach zimnego PBS. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów i wirować w temperaturze 290 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Rozbij osad komórkowy jak poprzednio i dodaj 10 mililitrów zimnego roztworu hipotonicznego do erytrocytów ługu.

Mieszaj, delikatnie obracając probówkę dokładnie przez minutę. Następnie dodaj 10 mililitrów zimnego roztworu hipertonicznego i przechowuj na lodzie. Teraz policz komórki po osadzeniu neutrofili przez odwirowanie.

Zawieszamy PMN na poziomie od 10 do siedmiu komórek na mililitr. W zimnym PBS utrzymuj komórki na lodzie. Porcjować 100 mikrolitrów zawiesiny PMN do 1,5 mililitrowych probówek einor.

Następnie dodać odpowiednie przeciwciało monoklonalne w ilości 10 mikrogramów na mililitr i inkubować na lodzie przez 15 minut. Aby umyć komórki, dodaj jeden mililitr zimnej wirówki PBS i odessaj supernatant. Następnie delikatnie rozbij osad komórkowy i umyj go jeszcze dwukrotnie PBS.

Aby usunąć niezwiązane przeciwciało, ponownie zawiesić przemyty PMN w tej samej początkowej objętości ciepłego PBS zawierającego 60 mikrogramów na mililitr inkubacji IgG go anti muse w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do 20 minut, w zależności od interesującego czynnika jądrowego. Teraz dodaj jeden mililitr zimnego PBS Po granulowaniu komórek przez odwirowanie, usuń snat i natychmiast zamroź granulki komórek w kąpieli etanolowej z suchym lodem. Dla każdej próbki wyjmij probówkę z wanny etanolowej z suchym lodem, wytrzyj do czysta i zregeneruj.

Zawiesić zamrożone granulki PMN w 100 mikrolitrach zimnego roztworu hipotonicznego. Umieść wszystkie próbki na lodzie w celu monitorowania próbek pod kątem integralności jąder. Zabarwić Eloqua zawiesiny jąder błękitem trianowym.

Jeśli zawiesina jąder zawiera wiele nienaruszonych komórek lub szczątków, lepiej jest wyrzucić preparat i rozpocząć procedurę od innej próbki. Po granulowaniu jąder przez odwirowanie, należy bardzo ostrożnie usunąć supernatant, a następnie utrwalić jądra w 100 mikrolitrach zimnego, 4% roztworu aldehydu Paraform i inkubować jądra na lodzie. Po zagnieżdżeniu jąder ostrożnie usunąć snat ze 100 mikrolitrów buforu do przenikania zimnego i inkubować próbki na lodzie przez 10 minut.

Następnie zbierz jądra perme przez odwirowanie. W tym momencie granulki jąder nie przyczepiają się dobrze na dnie rurki. Zaleca się ponowne odwirowanie przyszłości.

Jeśli osad się poluzuje Aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania, zawieszamy jądra w 500 mikrolitrach zimnej, 4% płodowej surowicy bydlęcej w PBS i inkubujemy na lodzie przez 20 minut. Osadzać jądra przez wirowanie, a następnie ponownie zawiesić jądra i 100 mikrolitrów zimnego PBS zawierającego 4% FBS i 2,5 mikrograma na mililitr przeciwciała monoklonalnego przeciwko interesującemu czynnikowi jądrowemu. Inkubować próbki na lodzie przez 20 minut po dwukrotnym umyciu próbek 500 mikrolitrami zimnego PBS z 4% FBS, zawieszamy jądra w 100 mikrolitrach zimnego PBS zawierającego 4% FBS i 10 mikrogramów mililitra odpowiedniego przeciwciała wtórnego znakowanego FZ inkubować na lodzie przez 20 minut po dwóch płukaniach, ponownie zawiesić jądra w 400 mikrolitrach zimnego 4% paraldehydu w PBS.

Przeanalizuj jądra znakowane immunologicznie w cytometrze przepływowym, takim jak skan faktów lub podobny aparat. Dostosuj ustawienia akwizycji: dwa FSC w skali logarytmu na 10 do ujemnego, SSC w skali logarytmu na 196 i jądra bramki na wykresie adoptowanym. Zdobądź 10 000 jąder z próbki.

Następnie przeanalizować fluorescencję jąder barwnika przez jeden kanał FL ustawiony w skali logarytmicznej na 400. Ta metoda oczyszczania PMN zwykle zapewnia niestymulowane neutrofile o czystości większej niż 95% z jąder PMN są izolowane z wysoką wydajnością, izolowane do jąder, można je łatwo rozpoznać jako inną populację niż nienaruszony PMN w cytometrze przepływowym z wykresem kropkowym po stymulacji. Poprzez sieciowanie beta one integryny NF kappa B są translowane do jądra, a ten przyrost jądrowego NF kappa B jest wykrywany jako wzrost fluorescencji.

Podobnie, stymulacja PMN poprzez sieciowanie integryn beta dwóch również indukuje aktywację NF kappa B, na co wskazuje wzrost fluorescencji. Czułość tej metody pozwala na wykrycie niewielkich zmian w poziomach czynników jądrowych, o czym świadczy fakt, że integryny beta one, które wiążą białka macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak fibronektyna, indukują silniejszą aktywację NF kappa B niż integryny beta dwa, które wiążą się z cząsteczkami adhezyjnymi na innych komórkach. Metoda ta charakteryzuje się dużą elastycznością, ponieważ można stosować wiele różnych fluorochromów, a ponieważ umożliwia przygotowanie jąder z różnych typów komórek, zastosowano to proste i ekonomiczne podejście do badań transdukcji sygnału, które obejmują zmiany poziomów białek w jądrze różnych typów komórek.