Analiza internalizacji komórkowej nanocząsteczek i bakterii przy użyciu wielospektralnej obrazującej cytometrii przepływowej

W celu analizy komórkowych mechanizmów internalizacji nanocząsteczek i bakterii za pomocą multispektralnej cytometrii przepływowej z obrazowaniem. Makrofagi są najpierw poddawane wstępnej obróbce cytochalasiną D w celu zahamowania polimeryzacji aktyny. Do monowarstwy makrofagów dodaje się nanocząsteczki lub salmonellę, a następnie inkubuje.

Następnie makrofagi są zbierane, utrwalane i znakowane w celu analizy z wykorzystaniem systemu ImageStream. Dzięki wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazującej można odróżnić komórki, które zinternalizowały nanocząsteczki i/lub salmonellę, od tych, w których nanocząsteczki i/lub salmonella są związane jedynie z powierzchnią. Otrzymane dane wskazują, że zarówno salmonella, jak i nanocząsteczki są internalizowane wyłącznie przez komórki, które nie zostały poddane działaniu cyto klain.

D sugeruje, że internalizacja jest zależna od aktyny. Technika ta posiada kilka zalet w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak cytometria przepływowa i mikroskopia konfokalna. Przede wszystkim zapewnia dokładny pomiar intensywności sygnałów fluorescencyjnych oraz rozdzielczość przestrzenną między różnymi strukturami komórkowymi przy wysokiej prędkości.

Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania zarówno w badaniach nad szczepionkami i dostarczaniem leków z wykorzystaniem biomateriałów, jak i w badaniach nad oddziaływaniami między patogenem a gospodarzem. Obejmuje to określanie szlaków internalizacji wykorzystywanych przez bakterie oraz nanocząsteczki polianhydrydów. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie często napotykają trudności.

Ważne jest poświęcenie czasu na miareczkowanie barwników w celu uzyskania optymalnych sygnałów fluorescencji. Ponadto zapoznanie się z oprogramowaniem i stworzenie szablonów analizy wymaga czasu. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy podczas stosowania mikroskopii i innych technik odkryliśmy, że polihydro-nanocząsteczki wykazują charakterystyki naśladujące patogeny.

Następnie pragnęliśmy zastosować system o wysokiej przepustowości do porównania procesów internalizacji wykorzystywanych przez salmonellę i nanocząstki hybrydowe z pyłku przed przeprowadzeniem testu. Wszystkie hodowle komórek ssaków i bakterii powinny zostać zebrane, a zawiesiny nanocząstek przygotowane. Należy rozpocząć od zebrania konfluentnych komórek RAW 264.7 za pomocą skrobaka do komórek.

Wyznaczyć liczbę komórek za pomocą cytometru hematologicznego. Następnie wysiać komórki do 24-dołkowej płytki hodowlanej w gęstości 5×10⁵ komórek na dołek w 0,5 ml pożywki Complete DMEM i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2.

Aby przygotować taricę salmonelli, należy rozcieńczyć transformowaną salmonellę w C-D-M-E-M, aby uzyskać wielokrotność infekcji (MOI) wynoszącą 100 na komórki RA W2 64.7 w szklanej probówce z nakrętką do autoklawowania o wymiarach 16 × 125 mm. Następnie, używając wysterylizowanego papieru do odważania, należy odważyć 5 mg nanopartuł polianhydrydu obciążonych 1% FITC, otrzymanych zgodnie z opisem współpracowników Reana w publikacji z 2009 roku w Pharmaceutical Research, do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Nanopartykuły należy dodać do 0,5 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym i umieścić w lodzie.

Przechowywać probówkę w lodzie. Użyć ultradźwiękowego procesora cieczy z mikrokońcówką, aby poddać zawiesinę sonikacji przez około 25 sekund przy energii od czterech do sześciu dżuli. Po przygotowaniu wszystkich niezbędnych komórek i odczynników można przeprowadzić test fagocytozy.

Oznacz 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowej zawierające hodowlę komórek RA W2 64.7 w przygotowaniu do analizy na pierwszej płytce. Każda z następujących próbek zostanie przebadana w trzech powtórzeniach: cyto D z nanocząsteczkami, cyto D z salmonella, medium z nanocząsteczkami, medium z salmonella, same nanocząsteczki, sama salmonella oraz same komórki barwione AF 60. Kontrole w temperaturze 4 °C zostaną przebadane na drugiej płytce i będą obejmować medium z nanocząsteczkami oraz medium z salmonella. Inkubacja w tej niskiej temperaturze spowalnia procesy komórkowe, takie jak fagocytoza. Na godzinę przed indukcją dodaj 5 µg/mL cyto D w DMEM do odpowiednich dołków i inkubuj komórki w temperaturze 37 °C.

Po inkubacji wymieszaj zawiesinę nanocząstek w wirułowniku typu vortex i dodaj 10 µL do odpowiednich dołków. Następnie wymieszaj w wirułowniku typu vortex kulturę salmonella i dodaj ją do odpowiednich dołków przy MOI wynoszącym 100. Kilkukrotnie stuknij płytką, aby wymieszać zawartość.

Następnie umieść płytki z próbkami w temperaturze 37 °C, a płytki z kontrolą ujemną w temperaturze 4 °C na 45 minut. Po inkubacji umieść płytki na lodzie, a następnie dwukrotnie przemyj komórki lodowatym PBS bez jonów wapnia i magnezu, odsysając i usuwając stare medium w celu usunięcia niezwiązanych cząsteczek, salmonelli oraz martwych lub oderwanych komórek. Zastosuj petal magnesium.

Zastosowanie PBS na tym etapie jest niezbędne, ponieważ ułatwia ono odrywanie komórek od podłoża. Aby zebrać komórki, należy dodać 250 µL lodowatego PBS i delikatnie zeskrobać zawartość dołków, a następnie przenieść zebrane komórki pipetą do silikonizowanych probówek do mikrowirówki z zatrzaskową zakrętką i przechowywać je w lodzie. Komórki należy przemyć, dodając 1 mL zimnego buforu do mycia, a następnie wirować z prędkością 250 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po odlaniu nadsączu należy usunąć resztki buforu, stukając odwróconą probówką o papier.

Resuspend pellet komórkowy, delikatnie przesuwając probówkę do mikrowirówki wzdłuż statywu na probówki. Aby utrwalić komórki, dodaj 100 µL 4% paraformaldehydu w PBS i pozostaw komórki na 15 minut. W temperaturze pokojowej przemyj komórki, dodając 1 mL buforu do przemywania Perm, a następnie wiruj przy 250 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.

Po odlaniu supernatantu usunąć pozostały bufor w sposób opisany wcześniej. Następnie przeprowadzić barwienie komórek RA W2 64.7. W celu wybarwienia aktyny dodać 100 µL buforu do przemywania z permeabilizacją zawierającego Alexa Fluora foid w six 60 na 15 minut.

W temperaturze pokojowej niebarwione próbki należy inkubować z perm, buforem do płukania bez phin. Po barwieniu komórki należy ponownie przemyć i odwirować, a następnie zawiesić w 50 µL PBS zawierającego 1% PFA i przechowywać w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu akwizycji. Włącz urządzenie, uruchom strumień obrazu i rozpocznij pracę.

Przeprowadź aspirację i inicjalizację układu płynowego w menu pliku. Wybierz opcję załadowania domyślnego szablonu. W galerii obrazów, w menu widoku, zaznacz wszystko i naciśnij „run setup”, aby rozpocząć obrazowanie kulek; w razie potrzeby dostosuj śledzenie rdzenia, aby wycentrować obrazy w płaszczyźnie bocznej.

Wybierz kanał jasnego pola i kliknij ustaw intensity. Poczekaj, aż współczynnik zmienności prędkości przepływu będzie stale mniejszy niż 0,2%. W zakładce pomoc kliknij start all, aby uruchomić kalibracje i testy, a następnie zweryfikuj w oprogramowaniu, czy wszystkie zostały pomyślnie zakończone. Kliknij load sample.

Następnie, zgodnie z instrukcją, należy umieścić fiolkę zawierającą próbkę o najwyższej fluorescencji. Po umieszczeniu wszystkich fluorochromów w ładowarce próbek należy wybrać powiększenie 40 x. Po ustaleniu ustawień instrumentu nie wolno ich zmieniać przez cały czas trwania eksperymentu.

Włącz każdy laser w doświadczeniu, klikając odpowiednie ikony laserów w oprogramowaniu, i ustaw moc laserów tak, aby każdy fluorochrom miał maksymalne wartości pikseli w zakresie do 104 000 zliczeń, pomiarze w wykresach rozrzutu. Aby wyeliminować zbieranie niepożądanych obiektów, kliknij okno klasyfikatora komórek w oprogramowaniu. Następnie, aby zbierać wyłącznie dane komórkowe, wybierz dolną granicę obszaru dla kanału jeden obrazowania w jasnym polu i ustaw wartość na 50 µm; obiekty o powierzchni mniejszej niż 50 µm zostaną uznane za zanieczyszczenia i nie zostaną zarejestrowane.

Wybierz kanały do rejestracji, klikając odpowiednie ikony kanałów w programie. W zakładce konfiguracji wybrano kanały 1, 2, 3, 4, 5 i 6. Wprowadź numer pliku oraz folder docelowy.

Ustaw numer sekwencji na jeden, a liczbę zdarzeń do pozyskania na 5 000. Kliknij run, acquire, aby zebrać i zapisać plik danych z pierwszego eksperymentu. Kliknij FLL i uruchom kolejną próbkę eksperymentalną.

Powtarzaj procedurę, aż do czasu zebrania wszystkich próbek eksperymentalnych. Następnie, aby uruchomić kontrole, kliknij w ustawienia kompensacji (comp settings). Spowoduje to wyłączenie pola jasnego oraz lasera rozproszenia i umożliwi zbieranie danych ze wszystkich kanałów fluorescencji w zakładce akwizycji (acquire tab).

Zmień wartość wejściową na 500. Następnie umieść probówkę kontrolną i kliknij „run”. Przeprowadź akwizycję, aby zebrać 500 komórek pozytywnych w kontrolach barwionych pojedynczo.

Powtórz tę procedurę dla każdego fluorochromu użytego w eksperymencie, aby opracować macierz kompensacji. Po zarejestrowaniu wszystkich obrazów próbek uruchom oprogramowanie analityczne ideas na osobnym komputerze analitycznym, klikając dwukrotnie ikonę ideas na pulpicie. Kliknij dwukrotnie w kreator internalizacji (internalization wizard) i załaduj jeden z plików RIF próbki testowej.

W wyskakującym oknie zostaną wyświetlone instrukcje dotyczące ładowania plików testowych. Postępuj zgodnie z instrukcjami i kliknij przycisk „dalej”. Następnie kliknij „nowa macierz”.

Uruchomi to kreator kompensacji. Po pojawieniu się prośby wybierz pliki danych dla kontroli jednobarwnych, aby je dodać. Przechodź przez kolejne kroki kreatora, postępując zgodnie z instrukcjami, aż plik macierzy kompensacji zostanie zapisany i wczytany do pola w kroku drugim kreatora internalizacji.

Kliknij Dalej i postępuj zgodnie z instrukcjami, aż zostanie wygenerowany plik A DAF. Ustaw właściwości wyświetlania obrazu, wybierając kanały obrazowania wykorzystane podczas akwizycji. Kliknij kanał drugi dla FITC oraz kanał piąty dla AF 660.

Domyślnie wybrane są pola jasnego pola (brightfield) oraz rozproszenie boczne (side scatter). Należy wybrać kanał jasnego pola O w celu wyznaczenia granic komórki oraz kanał O2, w którym zgromadziły się nanocząstki lub bakterie, dla sondy internalizacyjnej, aby zdefiniować populację pojedynczych komórek; następnie generowany jest wykres punktowy powierzchni jasnego pola względem współczynnika kształtu (aspect ratio) jasnego pola dla wszystkich komórek. Wysokoprzepustowa analiza wielu plików danych wymaga pliku szablonu, dlatego kluczowe znaczenie ma staranne zdefiniowanie bramek podczas tworzenia pliku szablonu.

Kropka reprezentuje wartości dla pojedynczego obrazu komórki. Kliknij pojedynczą kropkę na wykresie, aby wybrać obraz tej konkretnej komórki w galerii obrazów.

Następnie wyznaczyć bramkę wokół komórek o powierzchni i współczynniku kształtu (aspect ratio) odpowiadających pojedynczym zdarzeniom komórkowym. Pojedyncze komórki mają współczynnik kształtu bliski 1, natomiast dublety mają współczynnik kształtu około 0,5.

Kliknij w wiele komórek, aby odróżnić obszary zawierające pojedyncze komórki od dubletów lub debris. Aby wygenerować histogram pierwiastka średniej kwadratowej gradientu jasnego pola obrazu brightfield, kliknij przycisk Dalej.

Następnie w zakładce populacji (population) wybierz opcję bin, aby wyświetlić wybrany histogram. Kliknij w histogramy, aby określić położenie komórek i najlepszą ostrość. Rozpocznij i narysuj region liniowy, aby wyznaczyć bramkę dla komórek w ostrości.

Im wyższa wartość RMS gradientu, tym lepsze ogniskowanie; pomiń następny krok, chyba że istnieją inne barwniki do wyznaczenia bramki. Generowany jest nowy wykres rozrzutu, w którym na osi X znajduje się intensywność drugiego kanału, a na osi Y maksymalna wartość piksela drugiego kanału. Klikaj w kropki i przeglądaj obrazy, aby pomóc w wyznaczeniu obszaru bramkowania komórek wykazujących pozytywny wynik dla nanocząsteczek lub bakterii.

Generowany jest histogram cechy internalizacji z obszarem rozpoczynającym się od zera, który należy dostosować na podstawie obserwacji obrazów. Cecha internalizacji stanowi stosunek intensywności wewnątrz komórki do intensywności całej komórki. Jest ona skalowana w taki sposób, że wartość zero oznacza, iż połowa intensywności znajduje się wewnątrz.

Kreator utworzył w każdej komórce obszar wyznaczający wnętrze poprzez stworzenie maski, która posłużyła jako wejście obrazu komórki do znalezienia powierzchni komórki, a następnie została poddana erozji o cztery piksele. Należy pamiętać, że maskę tę można w razie potrzeby dostosować ręcznie dla różnych typów komórek, tworząc najpierw maskę obiektu na obrazie w jasnym polu, a następnie poddając ją erozji o większą lub mniejszą liczbę pikseli. Funkcja internalizacji jest obliczana na podstawie tej poddanej erozji maski obiektu przy użyciu algorytmu w oprogramowaniu.

Funkcja ta pozwala odróżnić cząsteczki i bakterie zinternalizowane, których większość sygnału fluorescencyjnego znajduje się wewnątrz granicy maski, od cząsteczek i bakterii związanych z powierzchnią, których większość sygnału fluorescencyjnego znajduje się poza granicą maski, jak pokazano w tym przykładzie. Utwórz nowy histogram z nową cechą internalizacji w oparciu o erodowaną maskę obiektu. Wyznacz obszar bramkowania dla zinternalizowanych komórek, wyświetlając obrazy w trybie wybranych koszyków (bin mode). Ustaw bramkę na wartości 0,3 tutaj.

Komórki z wynikiem niższym niż 0,3 są uznawane za komórki z cząsteczkami związanymi z powierzchnią. Aby wyeliminować komórki z etykietowaniem tła i zidentyfikować specyficzne zinternalizowane nanocząsteczki lub bakterie, wybierz funkcje z menu analizy. Kliknij menu analizy.

Następnie kliknij funkcję zliczania plamek (spot count), aby dodać średnią liczbę plamek do raportu statystycznego. W menu raportów kliknij ikonę raportów. Następnie zdefiniuj raport statystyczny, dodaj kolumny, a następnie wybierz odpowiednią populację komórek.

Kliknij OK. Kreator internalizacji automatycznie doda statystyki do tego raportu, aby zapisać plik danych jako plik szablonu, który zostanie wykorzystany do analizy seryjnej wszystkich plików eksperymentalnych. Kliknij menu plik i wybierz opcję zapisz jako szablon.

Pliki szablonów. Posiadają rozszerzenie .AST, co umożliwia analizę wielu plików danych w oprogramowaniu IDEA. Kliknij narzędzia (tools), wybierz seryjne pliki danych (batch data files), a następnie wprowadź wszystkie pliki RIF.

Dodaj plik macierzy kompensacji oraz plik szablonu w odpowiednich sekcjach, a następnie kliknij przycisk prześlij, aby przekazać partię do przetworzenia. Po etapie przetwarzania wszystkie pliki RAF zostaną przeanalizowane, a dla każdego z poszczególnych plików surowych zostaną wygenerowane pliki DAF. Na koniec zostanie utworzony raport końcowy zawierający statystyki dla wszystkich próbek w celu porównania wpływu inhibicji aktyny i niskiej temperatury na fagocytozę salmonelli oraz nanocząsteczek.

Komórki RAW 264.7 inkubowano w temperaturze 37°C w pożywce, z dodatkiem lub bez dodatku cytochalazyny D, bądź inkubowano w pożywce w temperaturze 4°C. Zarówno zmiana temperatury, jak i manipulacje dotyczące aktyny ograniczyły internalizację nanocząsteczek oraz Salmonella. Jednak inkubacja komórek z cytochalazyną D zwiększyła odsetek komórek z nanocząsteczkami związanymi z powierzchnią, jednocześnie zmniejszając odsetek komórek z Salmonella związanymi z powierzchnią.

Odsetek komórek z nanocząstkami związanymi z powierzchnią wzrasta z około 8% w 37 °C do ponad 35% po zastosowaniu cytochalazyny D lub inkubacji w 4 °C. W przeciwieństwie do tego, odsetek komórek z salmonellą związaną z powierzchnią uległ zmniejszeniu z 35% do 15% po zastosowaniu cytochalazyny D. Inkubacja komórek RAW 264.7 z salmonellą w 4 °C zmniejszyła internalizację, bez widocznego wzrostu ilości bakterii związanych z powierzchnią w porównaniu z kontrolą w 37 °C. Łącznie dane te wykazują, że salmonella i nanocząstki są internalizowane poprzez podobny proces komórkowy, który wymaga aktyny i jest zależny od temperatury.

Co więcej, dane wskazują, że trwałe przytwierdzenie salmonelli do makrofagów wymaga polimeryzacji aktyny. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak badać wewnątrzkomórkową internalizację nanocząstek i bakterii za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej z obrazowaniem. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że inhibitory wykazują działanie cytotoksyczne.

W związku z tym niezbędne jest przeprowadzenie wcześniejszych eksperymentów z profilowaniem cytotoksyczności w celu określenia optymalnych stężeń. Należy pamiętać, że praca z salmonellą może być niebezpieczna; podczas wykonywania tej procedury należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie odpowiedniego sprzętu ochrony indywidualnej oraz unikanie tworzenia aerozoli.