Retrogradne znakowanie fluorescencyjne umożliwia ukierunkowaną zewnątrzkomórkową rejestrację pojedynczych jednostek z zidentyfikowanych neuronów in vivo
26 czerwca 2013
Transport retrogradny barwnika fluorescencyjnego pozwala na oznakowanie subpopulacji neuronów na podstawie projekcji anatomicznej. Oznakowane aksony mogą być celowane wizualnie in vivo, co umożliwia rejestrację pozakomórkową z zidentyfikowanych aksonów. Technika ta ułatwia rejestrację w przypadkach, gdy neurony nie mogą zostać oznakowane poprzez manipulacje genetyczne lub gdy ich izolacja za pomocą „ślepych” metod in vivo jest utrudniona.
Ogólnym celem tej procedury jest rejestracja odpowiedzi pojedynczych jednostek in vivo z zidentyfikowanej populacji neuronów w niegenetycznym modelu systemowym. Zostaje to osiągnięte poprzez wykonanie w pierwszej kolejności kraniotomii w celu odsłonięcia interesującego obszaru mózgu. W drugim kroku wykorzystuje się druty wolframowe do wprowadzenia barwnika fluorescencyjnego do obszaru, do którego rzutują docelowe neurony.
Następnie barwnik jest transportowany w sposób retrogradowy, co prowadzi do selektywnego znakowania neuronów projekcyjnych. Ostatnim krokiem jest rejestracja sygnałów z oznakowanego aksonu pojedynczego neuronu projekcyjnego. W końcowym etapie wykorzystuje się pozakomórkowe rejestracje pojedynczych jednostek, aby wykazać, w jaki sposób centralne neurony sensoryczne w nienaruszonym obwodzie reagują na stymulację sensoryczną in vivo.
Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób obwody neuronalne wykrywają submilisekundowe różnice w czasie impulsów synaptycznych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest możliwość celowania w pojedyncze neurony, a nawet aksony, oraz w systemy niedostępne genetycznie. Słaboelektryczne ryby wykorzystują sygnały elektryczne do komunikacji i nawigacji.
Sygnały pochodzące od różnych ryb są rozróżniane dzięki różnicom w czasie wejść synaptycznych wynoszącym poniżej milisekundy. Postawiliśmy pytanie, w jaki sposób domniemane neurony komparatora czasu w ich obwodzie elektrosensorycznym są w stanie wykryć tak niewielkie różnice czasowe. Technikę tę można jednak zastosować również do innych układów, takich jak szlaki sensoryczne wzrokowe i słuchowe.
Wyodrębnienie tych komórek jest szczególnie trudne ze względu na ich niewielki rozmiar, gęste upakowanie w otaczającej tkance oraz zakończenia presynaptyczne, które pokrywają większą część ciała komórki. Wewnątrzkomórkowa iniekcja barwnika podczas rejestracji typu whole-cell in vitro pozwala na oznakowanie pojedynczej komórki w celu przeprowadzenia ukierunkowanych pomiarów z danego aksonu. Podobnie, transport retrogradowy po zewnątrzkomórkowej iniekcji barwnika umożliwia selektywne oznakowanie neuronów projekcyjnych w powierzchownych obszarach mózgu.
Można tego użyć do zapewnienia wizualnego prowadzenia podczas rejestracji pojedynczych jednostek in vivo. Aby przygotować igłę kodowaną barwnikiem D, należy najpierw zaostrzyć elektrolitycznie drut wolframowy o średnicy 160 µm do końcowej średnicy czubka igły wynoszącej od 5 do 50 µm. Następnie, w noc poprzedzającą eksperyment, należy zakodować czubek igły za pomocą 2 mM roztworu barwnika Alexa Fluor sprzężonego z dekstranem o masie cząsteczkowej 10 000 Da w celu indukowania znieczulenia ogólnego.
Umieść rybę w wodzie z akwarium z roztworem MS 2 22 w stężeniu 300 mg/L; unieruchom i wycisz elektrycznie rybę, wstrzykując 100 µL flail w stężeniu 3 mg/mL do mięśni grzbietowych ciała. Następnie napełnij komorę rejestracyjną wodą z akwarium i ułóż rybę stroną brzuszną do dołu na platformie w centrum komory. Następnie podawaj napowietrzony roztwór MS 2 22 w stężeniu 100 mg/L w tempie od 1 do 2 mL/min, umieszczając końcówkę pipety w pysku ryby.
Następnie ustabilizuj rybę za pomocą przymocowanych prętów i wosku po obu stronach ciała. Monitoruj stan zdrowia ryby, sprawdzając ciągłość przepływu krwi w naczyniach ocznych oraz prawidłowy kolor ciała. Następnie obróć platformę wokół osi pionowej.
Ustaw jeden koniec platformy tak, aby jedna strona powierzchni grzbietowej głowy ryby znajdowała się nad powierzchnią wody, podczas gdy reszta ciała ryby pozostawała zanurzona. Umieść niewielki kawałek chusteczki Kimwipe na każdej niezanurzonej części skóry, aby zapobiec jej wysychaniu. W tej procedurze nanieś 0,4% lidokainy na odsłoniętą powierzchnię głowy za pomocą patyczka higienicznego.
Następnie za pomocą ostrza skalpela wyciąć prostokątny fragment tkanki skórnej o wymiarach około trzech milimetrów na pięć milimetrów dla ryby o długości 6,2 centymetra. Boczna krawędź prostokąta powinna znajdować się na wysokości środka oka. Przednia krawędź prostokąta powinna znajdować się tuż za okiem, a krawędź przyśrodkowa tuż bocznie od linii środkowej.
Następnie usuń prostokąt za pomocą pęsety. Wytnij dodatkowy kwadrat o boku 2,5 milimetra przedniej strony, aby odsłonić czaszkę. Całkowicie oczyść odsłoniętą powierzchnię czaszki, zeskrobując nadmiar tkanki ostrzem skalpela.
Następnie całkowicie osusz powierzchnię za pomocą chusteczki Kim wipe i strumienia powietrza. Dalej, za pomocą superkleju przyklej metalowy trzpień do przednio-przyśrodkowego odsłoniętego obszaru czaszki. Odczekaj do całkowitego wyschnięcia kleju.
Używając wiertarki stomatologicznej z karbidową końcówką kulistą o średnicy 0,5 mm, wyznacz na czaszce ryby o długości 6,2 cm prostokąt o wymiarach około dwóch na cztery milimetry. Następnie wytnij obrys prostokąta za pomocą skalpela i pęsety. Po tym odwarstw czaszkę.
Aby odsłonić mózg, należy przeciąć pigmentowaną oponę twardą oraz przezroczystą oponę miękką za pomocą nożyczek sprężynowych lub igły. Następnie usunięte fragmenty należy zebrać pęsetą, aby odsłonić przednie oraz tylne jądro dodatkowe boczne. Teraz należy ustawić manipulator z przygotowaną wcześniej igłą pokrytą substancją D nad regionem docelowym zawierającym analizowane aksony.
W naszym przypadku do tylnego jądra bocznego zewnętrznego należy szybko wprowadzić igłę na głębokość około 25 micrometers w tkankę. Po dyfuzji barwnika przez 15 do 30 sekund należy wycofać igłę. W razie potrzeby powtórzyć czynność, używając kolejnych nowych igieł.
Umieść każdą z nich w innym miejscu, tak aby barwnik rozprzestrzenił się w całym obszarze docelowym. Następnie wypłucz nadmiar barwnika z jamki za pomocą roztworu Ringera Hickmana i odczekaj co najmniej dwie godziny do czasu wchłonięcia i transportu barwnika. Aby zwizualizować interesujące aksony, umieść komorę rejestracyjną z rybą pod obiektywem odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z epifluorescencją i nieruchomym stolikiem.
Zmień roztwór oddechowy na świeżą wodę z akwarium, utrzymując taką samą prędkość przepływu. Następnie umieść jeden koniec przewodu uziemiającego w odsłoniętej jamie mózgowej, a drugi koniec podłącz do uziemienia głowicy rejestrującej. Następnie umieść parę elektrod rejestrujących obok podstawy ogona.
Następnie podłącz elektrody do wzmacniacza różnicowego i urządzenia rejestrującego. Aby monitorować sygnał sterujący wyładowaniem organu elektrycznego (EODC), przygotuj skalowany szkic obszaru mózgu oglądanego przy małym powiększeniu, uwzględniając główne naczynia krwionośne jako punkty orientacyjne do zidentyfikowania dokładnej lokalizacji oznakowanych aksonów. W celu potwierdzenia rozmieszczenia elektrody D, najpierw obejrzyj całą tkankę przy użyciu oświetlenia w polu jasnym w celu orientacji.
Następnie należy obejrzeć preparat przy użyciu oświetlenia fluorescencyjnego. Tylne jądro pozaboczne powinno wykazywać rozproszone znakowanie. Po tym etapie, przy dużym powiększeniu, należy zlokalizować przednie jądro pozaboczne, wykorzystując naczynia krwionośne jako punkty orientacyjne.
Oświetl próbkę światłem fluorescencyjnym, poszukując znakowanego aksonu w pobliżu powierzchni, używając szklanej kapilary borokrzemianowej o średnicy zewnętrznej 1 mm i średnicy wewnętrznej 0,58 mm z filamentem. Wytnij elektrodę rejestrującą z wąskim, 5 mm długim trzonem i średnicą końcówki wynoszącą od około 1 do 2,4 µm.
Napełnij elektrodę przefiltrowanym roztworem Ringera Hickmana. Końcowa rezystancja końcówki powinna mieścić się w zakresie od 16 do 155 mega omów. Umieść elektrodę w uchwycie do elektrod z portem ciśnieniowym.
Podłącz go do modułu głowicy zamontowanego na manipulatorze. Następnie podłącz moduł głowicy do wzmacniacza. Urządzenie do akwizycji sygnałów analogowo-cyfrowych, niewykazane na schemacie, łączy wzmacniacz z komputerem.
Następnie przyłóż dodatnie ciśnienie 30 millibar do linii elektrody. Powoli przesuwaj elektrodę od powierzchni tkanki w kierunku aksonu. Gdy elektroda znajdzie się blisko aksonu, dodatnie ciśnienie powinno spowodować niewielki, lecz zauważalny ruch aksonu w momencie, gdy elektroda znajduje się obok niego.
Zarejestruj aktywność podczas prezentacji bodźców testowych. Chociaż artefakt elektryczny potwierdza prawidłowy zapis i stymulację, nie powinny wystąpić potencjały czynnościowe. Zwolnij nacisk zewnętrzny na elektrodę, a następnie powtórz stymulację i rejestrację.
Następnie zastosuj lekkie podciśnienie, aby akson przesunął się do wnętrza elektrody. Powtórz stymulację i rejestrację. Teraz powinny pojawić się potencjały czynnościowe w odpowiedzi na stymulację.
Gdy potencjały czynnościowe staną się widoczne, zamknij linię ciśnienia. Po zakończeniu wszystkich wymaganych pomiarów, przełącz wodę w zbiorniku z powrotem na roztwór oddechowy z MS 222 w stężeniu 100 mg/l, aby upewnić się, że ryba jest całkowicie znieczulona. Przed eutanazją ryby przez co najmniej 10 minut nie powinno być wykrywane żadne EODC.
Oto pięć przykładowych zapisów obrazujących potencjały czynnościowe wywołane jednofazowym, przeciwstawnym, pozytywnym poprzecznym impulsem prostokątnym o czasie trwania 0,1 ms i natężeniu 6 mV/cm, a tutaj znajduje się wykres rastrowy pokazujący czasy wystąpienia impulsów podczas 20 powtórzeń 75 ms okna rejestracji dla tej samej jednostki stymulowanej w czasie zero bodźcami o natężeniu 6 mV/cm. Zakres czasów trwania jest wyszczególniony po prawej stronie. Przedstawiono tutaj krzywą dostrojenia do czasu trwania bodźca, która określa odpowiedzi jako liczbę impulsów na powtórzenie bodźca.
Po opanowaniu techniki, zabieg chirurgiczny i wstrzykiwanie barwnika przedstawione w niniejszej procedurze mogą zająć jedną godzinę przy prawidłowym wykonaniu, a rejestrację można rozpocząć od dwóch do trzech godzin po wstrzyknięciu barwnika. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby uważnie monitorować stan zdrowia zwierzęcia doświadczalnego po zakończeniu zabiegu. W celu rejestracji aktywności neuronów w jeszcze głębszych strukturach mózgu można zastosować inne metody, takie jak obrazowanie dwufotonowe.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dogłębną wiedzę na temat tego, jak znakować i rejestrować odpowiedzi pojedynczych jednostek z zidentyfikowanej populacji neuronów.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę rejestracji odpowiedzi pojedynczych jednostek z zidentyfikowanych neuronów in vivo z wykorzystaniem transportu wstecznego barwnika fluorescencyjnego. Technika ta umożliwia selektywne znakowanie neuronów projekcyjnych, co ułatwia ukierunkowane rejestracje pozakomórkowe w niegenetycznych systemach modelowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Obwody neuronalne
Wstęp
- Rejestracja sygnałów ze specyficznych neuronów jest kluczowa dla zrozumienia obwodów neuronalnych.
- Tradycyjne metody mogą nie być skuteczne w znakowaniu neuronów w systemach niegenetycznych.
- Barwniki fluorescencyjne mogą być wykorzystywane do znakowania neuronów na podstawie ich projekcji anatomicznych.
- Podejście to jest szczególnie użyteczne w badaniu neuronów sensorycznych u ryb elektrycznych.
Cel badania
- Opracowanie techniki rejestracji in vivo z zidentyfikowanych neuronów.
- Zbadanie reakcji neuronów sensorycznych na bodźce.
- Udoskonalenie możliwości celowania w poszczególne neurony w złożonych tkankach.
Zastosowane metody
- Kraniotomia w celu odsłonięcia interesującego obszaru mózgu.
- Wstrzyknięcie barwnika fluorescencyjnego do obszarów docelowych w celu znakowania neuronów projekcyjnych.
- Wykorzystanie drucików wolframowych do precyzyjnego umieszczenia barwnika.
- Rejestracja zewnątrzkomórkowa z oznakowanych aksonów w celu oceny odpowiedzi neuronów.
Główne wyniki
- Skuteczne znakowanie neuronów projekcyjnych za pomocą transportu wstecznego barwnika.
- Zdolność do rejestracji odpowiedzi pojedynczych jednostek z zidentyfikowanych neuronów.
- Wykazano przydatność tej techniki do badania różnic czasowych w obwodach sensorycznych.
- Zapewniono prowadzenie wizualne dla ukierunkowanych rejestracji in vivo.
Wnioski
- Metoda ta umożliwia ukierunkowane rejestracje z konkretnych neuronów w systemach niegenetycznych.
- Podejście to można zastosować do różnych dróg sensorycznych poza rybami elektrycznymi.
- Stanowi ono znaczącą przewagę nad tradycyjnymi metodami w złożonych środowiskach tkankowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia ukierunkowane rejestracje pojedynczych jednostek z zidentyfikowanych neuronów w systemach modelowych niegenetycznych, rozwiązując kluczowy problem w badaniach neuronaukowych, w których narzędzia genetyczne są niedostępne. Dzięki zastosowaniu wstecznego znakowania fluorescencyjnego opartego na projekcjach aksonalnych, badacze mogą wstępnie zwizualizować i selektywnie rejestrować sygnały z konkretnych populacji neuronalnych, co zwiększa niezawodność i interpretowalność danych elektrofizjologicznych. Zdolność ta wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w walidacji celów poprzez powiązanie tożsamości neuronu z jego funkcją w nienaruszonych obwodach, co jest wartościowe w przedklinicznej neuronauce oraz w odkrywaniu translacyjnych biomarkerów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez powiązanie tożsamości neuronów z ich funkcją elektrofizjologiczną in vivo.
- Wartość operacyjna: Zapewnia wskazówkę wizualną dla ukierunkowanych rejestracji, co ogranicza przypadkowe próbkowanie i zwiększa jakość danych w tkankach heterogenicznych.
- Pewność prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez potwierdzenie, że rejestrowane sygnały pochodzą z anatomicznie zdefiniowanych neuronów projekcyjnych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość testu: Tworzy zestandaryzowany, powtarzalny system przygotowania znakowanych neuronów do dalszej oceny elektrofizjologicznej.
- Wynik ilościowy: Umożliwia pomiar odpowiedzi pojedynczych jednostek na bodźce sensoryczne, dostarczając danych przydatnych do skriningu związków.
- Wielokrotne wykorzystanie platformy: Podejście oparte na znakowaniu wstecznym może być adaptowane do różnych obszarów mózgu i systemów modelowych, co wspiera skalowalność w procesach odkrywania leków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- System istotny dla choroby: Zastosowanie w obwodach przetwarzania sensorycznego, dostarczające wglądu w neuronalne mechanizmy wykrywania bodźców i dyskryminacji czasowej.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z badaniami przedklinicznymi poprzez umożliwienie spójnej identyfikacji celów neuronalnych w kolejnych sesjach eksperymentalnych.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich podczas walidacji celów, zapewniając, że rejestracje są pobierane z zamierzonej populacji neuronów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w początkowy etap procesu odkrywania, wspierając badanie obwodów neuronalnych w oparciu o postawione hipotezy, przed przejściem do etapów identyfikacji wiodących cząsteczek oraz walidacji przedklinicznej.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez, umożliwiając badaczom rejestrację sygnałów z neuronów zdefiniowanych przez ich wzorce projekcji, co pozwala wyjaśnić role funkcjonalne w przetwarzaniu sensorycznym.
- Screening: Generuje powtarzalne i mierzalne odczyty elektrofizjologiczne, które mogą być wykorzystane do oceny odpowiedzi neuronalnych w kontrolowanych warunkach.
- Analityka: Pozwala na wyznaczenie krzywych dostrojenia czasu i czasu trwania impulsów, co umożliwia ilościowe porównanie odpowiedzi neuronalnych dla różnych bodźców lub warunków.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przejścia od odkryć na poziomie obwodów neuronalnych do modeli przedklinicznych, dostarczając niezawodnej metody identyfikacji i ponownego celowania w konkretne neurony.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Podstawowa technika znakowania barwnikami retrogradnymi jest możliwa do zastosowania w różnych regionach mózgu i u różnych gatunków, co czyni ją uniwersalnym narzędziem w ramach programów badawczych w neuronauce.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki anatomicznie precyzyjnemu celowaniu.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację rejestracji pojedynczych jednostek poprzez wstępną wizualizację neuronów docelowych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go we wczesnej fazie odkrywania, zwiększając prawdopodobieństwo, że obserwowane fenotypy są powiązane z zamierzonym celem neuronalnym.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowaną tożsamość i funkcję neuronów w nienaruszonych obwodach.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu neuroanatomii, mikrochirurgii oraz elektrofizjologii in vivo.
- Zależny od dostępu do mikroskopii fluorescencyjnej, mikromanipulatorów oraz sprzętu do rejestracji zewnątrzkomórkowej.
- Wymaga standaryzacji parametrów wstrzykiwania barwnika i czasów transportu pomiędzy użytkownikami i laboratoriami.
- Należy uwzględnić zmienność wzorców projekcji aksonalnych podczas stosowania metody w nowych systemach modelowych lub regionach mózgu.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zależność od sukcesu transportu retrogradnego, który może różnić się w zależności od stanu tkanek i właściwości barwnika.
