Rejestrowanie aktywności elektrycznej ze zidentyfikowanych neuronów w nienaruszonym mózgu ryb transgenicznych

Ogólnym celem tej procedury jest rejestrowanie aktywności elektrycznej neuronów w nienaruszonym preparencie mózgu ryby. Osiąga się to poprzez najpierw znieczulenie transgenicznej transgenicznej ryby meca w MS 2 22, a następnie wypreparowanie jej mózgu. Następnie jeden z interesujących neuronów oznaczonych przez GFP jest kontaktowany z elektrodą rejestrującą, a jego aktywność elektryczna jest rejestrowana przez elektrofizjologię luźnej łaty lub całej komórki.

Ostatecznie wyniki mogą wykazać zmiany w częstotliwości wystrzeliwania potencjałów czynnościowych lub zmiany w potencjale błonowym w odpowiedzi na różne terapie w nienaruszonym mózgu. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak elektrofizjologia komórek i hodowla lub preparaty wycinków mózgu, jest to, że możemy scharakteryzować właściwości elektryczne neuronów w całym preparacie mózgu z nienaruszonymi obwodami neuronalnymi. Chociaż te mierzone zapewniają wgląd w neuroendokrynologię reprodukcyjną, można je również zastosować w innych systemach neurologicznych za pomocą ryb resenowych, takich jak neurony kontrolujące motywację i zachowania afektywne.

W tej demonstracji wykorzystuje transgeniczne ryby meca, w których trzy neurony GnRH są genetycznie znakowane GFP, aby rozpocząć znieczulenie dorosłego maka, zanurzając go w pięciu mililitrach MS 2 22. Kilka minut po ustaniu ruchów skrzeli przenieś go na 60-milimetrową szalkę Petriego z solą fizjologiczną dla ryb. Teraz użyj nożyczek, aby odciąć głowę ryby na dosierpowym końcu ałunu.

Przenieś głowę na szalkę Petriego o średnicy 35 milimetrów, wypełnioną do połowy solą fizjologiczną i wyłożoną osłoną ylową. Naczynie wymaga centralnego zagłębienia, w którym należy ustawić i zabezpieczyć głowę grzbietową stroną do góry za pomocą szpilek na owady z drobnymi nożyczkami. Ostrożnie rozetnij grzbietową część czaszki na całym jej obwodzie.

Następnie delikatnie usuń czaszkę kleszczami, odsłaniając grzbietową część mózgu, w tym przednią część rdzenia kręgowego. Teraz delikatnie podnieś rdzeń kręgowy za pomocą kleszczyków z cienką końcówką, a następnie przetnij obustronne nerwy łączne za pomocą nożyczek z cienką końcówką. Obejmuje to przecięcie nerwów czaszkowych, nerwów rdzeniowych, nerwów wzrokowych po stronie brzusznej i nerwów węchowych przednich.

Umieść całkowicie wypreparowany mózg na nowej szalce Petriego wypełnionej solą fizjologiczną ze świeżych ryb pod mikroskopem. Dokładnie sprawdź, czy cały mózg i przysadka mózgowa są nienaruszone i nie są przecięte ani przekłute. Wyrzuć uszkodzone mózgi i zacznij od nowa, używając igły.

Umieść małą kroplę szybko działającego kleju, takiego jak cyjanoakrylan, na środku komory nagrywania. Rozprowadź kroplę kleju na centymetrze kwadratowym. Następnie szybko przenieś mózg do kleju.

Zabezpiecz go brzuszną stroną do góry. Teraz napełnij komorę nagraniową około mililitrem soli fizjologicznej z ryb, aby przykryć mózg. Używając kleszczyków z cienką końcówką, ostrożnie usuń opony mózgowe nad powierzchnią obszaru nagrywania mózgu, idąc do przodu.

Stale perfować mózg napowietrzoną solą fizjologiczną z ryb w tempie co najmniej 200 mikrolitrów na minutę. Wykonaj około 6 do 10 megaomów szklanych mikroelektrod i wypełnij je mniej więcej do połowy luźnym roztworem do nagrywania łatek. Używając pionowego mikroskopu fluorescencyjnego z chłodzoną kamerą CCD, znajdź GFP wyrażający nerw końcowy gn RH trzy neurony, zaczynając od obiektywu 10x.

Następnie przełącz się na obiektyw 40 x i zlokalizuj neurony na lub w pobliżu brzusznej powierzchni opuszki węchowej tuż przed głowowem. Teraz przełącz się na monitor wideo, który zapewnia obrazy z mikroskopu w czasie rzeczywistym. Klaster neuronów zawiera od ośmiu do 10 neuronów GnRH.

Umieść mikroelektrodę w kąpieli komory rejestracyjnej tak, aby końcówka elektrody znajdowała się nad docelowym neuronem. Stosuj stałe, lekkie nadciśnienie, aby mikroelektroda się nie zatkała. Delikatnie zbliż się do docelowego neuronu końcówką elektrody, sprawdź i monitoruj rezystancję elektrody za pomocą oprogramowania do przeszczepów Axo.

Korzystając z testu szczelności w trybie cęgów napięciowych, gdy końcówka elektrody znajduje się na powierzchni neuronu, rezystancja elektrody zmienia się nieznacznie w tym momencie. Zwolnij nadciśnienie, aby wykonać uszczelnienie o niskiej rezystancji, w razie potrzeby zastosuj lekkie podciśnienie. Najważniejszym krokiem dla dobrego nagrania jest wybór czystego ramienia neurologicznego, które może pomóc w wykonaniu idealnego uszczelnienia między elektrodami a tą samą membraną.

Teraz przełącz się na bieżący tryb cęgów. Otwórz wykres, program laboratorium energetycznego i rozpocznij ciągłe rejestrowanie napięcia membrany bez żadnego prądu, w razie potrzeby dostosuj skalę napięcia i szybkość nagrywania, zapisz podstawową aktywność elektryczną w normalnej soli fizjologicznej dla ryb przez około pięć minut przed zastosowaniem jakichkolwiek zabiegów. Do preparatu mózgu należy dodać perfuzję leków, hormonów, peptydów i tak dalej, płynącą z prędkością 200 mikrolitrów na minutę.

Następnie użyj zwykłej soli fizjologicznej dla ryb przez okres wymywania po zlokalizowaniu kontroli ogniwa i monitoruj rezystancję elektrody w trybie cęgów napięciowych. Gdy końcówka elektrody znajduje się na powierzchni neuronu, a rezystancja elektrody zmienia się nieznacznie. Zwolnij nadciśnienie i zastosuj niewielkie podciśnienie, aby uzyskać uszczelnienie o wysokiej rezystancji na neuronze.

Zastosuj delikatne ssanie przez usta. Rozerwij załataną błonę komórkową. Rezystancja natychmiast spadnie do około 120 do 250 megaomów, gdy membrana pęknie.

Teraz przełącz się w tryb cęgów prądowych i rejestruj napięcie membrany w sposób ciągły za pomocą wykresu bez żadnego prądu wejściowego. Ponownie dostosuj skalę napięcia i szybkość nagrywania zgodnie z potrzebami Po wykonaniu podstawowego zapisu aktywności elektrycznej w normalnym roztworze soli fizjologicznej dla ryb przez około pięć minut, zastosuj zabiegi, a następnie okres wypłukiwania. Spontaniczne aktywności elektryczne nerwu końcowego moca GNRH trzech neuronów zarejestrowano w trybie zacisku prądowego.

Typowa szybkość wyzwalania wynosi od 0,5 do sześciu herców. Potencjały zazwyczaj wystrzeliwują w toniczny lub dudniący wzór z dość regularnym interwałem między kolcami, potencjał membrany międzykolcowej wynosi średnio około minus 48 miliwoltów. To eksperymentalne podejście jest również skuteczne w rejestrowaniu z neuronów GNRH znakowanych GFP zlokalizowanych w przodomózgowiu dorosłego transgenicznego.

Aktywność elektryczna neuronu zebry w wyciętym nienaruszonym mózgu transgenicznym. Danio pręgowany został zarejestrowany w podobny sposób, jak opisano dla DACA za pomocą luźnej łatki. Te same techniki zapewniały również nagrywanie całych komórek.

W przeciwieństwie do neuronów GnRH nerwu końcowego meca, wzorzec spontanicznego działania, potencjalne wystrzeliwanie neuronów GnRH zebry w obszarze przedoperacyjnym, brzusznym cefalonie i podwzgórzu jest często nieregularne Po opanowaniu. Tę technikę można wykonać w ciągu godziny na 15 minut nagrania, jeśli wykonasz ją prawidłowo. Powodzenia.