Rozwój zapalenia obliteracyjnego oskrzelików w mysim modelu ortotopowego przeszczepienia płuc

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ustanowienie modelu iteratywnego zapalenia oskrzelików odzwierciedlającego ortotopowy przeszczep płuc. Osiąga się to poprzez pobranie płuca dawcy od myszy C 57 BL 10. Drugim krokiem jest przygotowanie mankietu oskrzela, tętnicy płucnej oraz żyły do anastomozy.

Następnie przygotowane płuco dawcy zostaje przeszczepione do myszy biorcy C57BL/6. Ostatnim krokiem jest obserwacja przeszczepionej myszy przez 21 lub 28 dni po transplantacji. W końcowej fazie stosuje się analizę histologiczną, aby wykazać zmiany zapalne w obrębie oskrzelików w przeszczepionym płucu.

Główną zaletą tego modelu w porównaniu z lustrzanym modelem heterotopicznego przeszczepu dróg oddechowych jest to, że obecny model naśladuje stan ludzki. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ wyższe struktury u myszy są bardzo delikatne i bardziej podatne na urazy, gdyż ich masa stanowi zaledwie 1/10 masy szczura. Umieść mysz dawcę w szczelnej komorze utrzymującej i wprowadź w stan znieczulenia za pomocą 5% isofluranu. Następnie użyj cewnika dożylnego 20G, aby zaintubować tchawicę myszy, a następnie podłącz ją do respiratora dla gryzoni.

Utrzymuj znieczulenie, stosując od 1 do 2% isofluoranu. Po upewnieniu się, że mysz jest w pełni znieczulona (brak reakcji na bodziec ucisku ogona i palca), ułóż ją w pozycji grzbietnej i przygotuj brzuch, przemywając go 70% alkoholem. Następnie za pomocą nożyczek wytnij skórę nadbrzusza, aby odsłonić mięśnie brzucha.

Następnie wykonaj laparosternotomię, zaczynając od nacięcia w linii pośrodkowej przez ścianę brzucha, a następnie przecinając poprzecznie mostek; odsuń jelita i zlokalizuj żyłę główną dolną, która znajduje się bezpośrednio pod wątrobą. Wstrzyknij heparynę w dawce 100 µl/kg do żyły głównej dolnej. Następnie odciągnij w dół więzadło sierpowate wątroby i przetnij przeponę wzdłuż brzusznego przyczepu ogonowego w kierunku kręgosłupa.

Przetnij obie strony klatki piersiowej aż do szyi, aby odsłonić jamę klatki piersiowej. Przetnij klatkę piersiową obustronnie, chroniąc płuca, i usuń grasicę. Następnie przetnij wewnątrzklatkową część IVC na poziomie przepony.

Następnie zlokalizuj serce i wycięte przedsionkowe uszko prawe. Wykonaj nacięcie poprzeczne u nasady pnia tętnicy płucnej, a następnie wykorzystaj to nacięcie do przepłukania płuc 2 mL schłodzonego roztworu Ringera z mleczanem oraz 0,1 mL heparyny. Obnaż tchawicę, a następnie odetnij ją wraz z przełykiem.

Następnie przerwij wentylację przy dwóch trzecich objętości wdechowej na końcu wydechu. Wyciąć blok serca i płuc i przechowywać go w lodzie. Na wyciętym płucu położyć gazę, aby chronić je przed światłem.

Naciąć więzadło płucne aż do żyły płucnej lub pv. Usunąć przełyk i aortę, aby zlokalizować wnękę. Odnaleźć tętnicę płucną lub pa, która znajduje się w najbardziej kranialnej części wnęki, oraz przylegający do niej oskrzele główne.

Ostrożnie oddziel tętnicę płucną od oskrzela. Następnie wykonaj mankiet PA z kaniuli do dożylnego podawania leków o rozmiarze 24 G, odcinając fragment o długości 0,5 mm z przedłużeniem 0,7 mm. Powierzchnia mankietu jest pleciona AB.

Aby zapewnić powierzchnię do anastomozy, wykonaj mankiet dla oskrzela, używając materiału analogicznego do mankietu tętnicy płucnej (PA), wykorzystując jedynie cewnik 20 G docięty do długości 1 mm z przedłużeniem 0,7 mm. Rozmiar mankietu żyły płucnej (PV) zależy od masy myszy donora. Dla myszy o masie od 24 do 27 g.

Rozmiar mankietu to 22G o długości 0,7 mm i przedłużeniu 0,7 mm dla myszy o masie od 27 do 32 g. Długości są takie same, lecz stosowany jest cewnik 20G. Następnie wprowadź mankiety do dystalnych odcinków tętnicy płucnej, żyły płucnej i oskrzela, mocując każdy z nich szwem jedwabnym 9-0.

Po prawidłowym przymocowaniu wszystkich mankietów, owinąć przygotowaną płucno dawcy gazą nasączoną roztworem Ringera z mleczanem i umieścić na lodzie do czasu transplantacji. Aby przygotować mysz biorcę, wprowadzić znieczulenie i podłączyć do wentylacji mechanicznej w taki sam sposób, w jaki zrobiono to u dawcy.

Wygolić lewą ścianę klatki piersiowej i przygotować ją za pomocą 70% alkohol. Rozpocząć od wykonania nacięcia torakotomii w lewej trzeciej przestrzeni międzyżebrowej. Przedłużyć nacięcie grzbietowo w stronę kręgosłupa.

Należy upewnić się, że pole operacyjne zostało obłożone sterylnymi chustami, a następnie założyć zacisk do mikro naczyń na lewe naczynia płucne i oskrzele w sąsiedztwie serca. Tętnica płucna jest widoczna od strony głowowej, żyła płucna u dystalnego końca wnęki, a oskrzele pomiędzy nimi. Następnie, za pomocą hemostatu, należy delikatnie pociągnąć, aby wywrzeć lekki nacisk na pa, PV i oskrzele.

Pozostaw struktury wnęki zaklampowane i ostrożnie przeprowadź resekcję lewego płuca. Wyizoluj tętnicę płucną, żyłę płucną oraz oskrzele, a następnie nałóż luźne szwy wokół każdej z tych struktur. Całkowicie odpreparuj tętnicę płucną z jej osłonkiy zewnętrznej, a następnie wykonaj niewielkie nacięcie poprzeczne o długości około jednej czwartej obwodu naczynia w ścianie przedniej.

Pozostawiając nienaruszoną kontynuację grzbietowej części tętnicy, należy pobrać płuca dawcy, które są owinięte w nasączoną zimnym roztworem Ringera z mleczanami gazą bawełnianą, i umieścić je w jamie klatki piersiowej. Następnie należy wprowadzić mankiety do tętnicy płucnej (pa), żyły płucnej (PV) oraz oskrzela biorcy w celu wykonania anastomozy i podwiązać je nano-szwem. Na koniec należy usunąć płuco biorcy.

Następnie należy zdjąć zacisk na wnęce, co umożliwi reperfuzję i wentylację. Przesunąć przeszczepione płuco z powrotem do klatki piersiowej biorcy i zamknąć nacięcie torakotomiczne, używając szwu 5-0. Mysz powinna teraz dojść do siebie po znieczuleniu. W celu uśmierzenia bólu po odzyskaniu przez mysz przytomności można podać buprenorfinę.

Tabela ta przedstawia oceny histologiczne odrzucania ostrego oraz częstość występowania zapalenia bronchioli z obliteracją (OB). Ocena odrzucania ostrego po przeszczepieniu jest określana jako wynik A. Kombinacje allograftów wykazują znacznie więcej patologii odrzucania ostrego lub przewlekłego w porównaniu z graftem ISO. Ponadto częstość występowania zapalenia bronchioli z obliteracją była istotnie wyższa w kombinacjach allograftów niż w grafcie ISO w 21. i 28. dniu po przeszczepieniu.

Tutaj przedstawiono wyniki makroskopowe i histopatologiczne 28 dni po transplantacji płuc. Obrazy te przedstawiają wyniki makroskopowe oraz barwienie H i E przeszczepionego płuca ISO oraz prawego płuca naiwnego. Obrazy te przedstawiają barwienie H i E oraz masen trireme allograftu płuca BL 10 przeszczepionego biorcy myszy BL six, u którego rozwinęło się odpowiednio OB i non OB.

Biała strzałka w panelu B wskazuje zmiany OB. Panel ten przedstawia biorcę myszy BL 10 po przeszczepieniu allograftu płuca od myszy BL 6. Po opanowaniu tej techniki, jej wykonanie zajmuje niemal pół godziny, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo.

Użyteczność tej techniki polega na tym, że może ona zostać wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na pytania dotyczące mechanizmów dysfunkcji pierwotnej przeszczepu, odrzucania ostrego oraz bronchiolitis ablacyjnego po transplantacji płuc.