Łączenie mikrofluidyki z układami mikroelektrod do badania komunikacji neuronalnej i propagacji sygnałów aksonalnych
8 grudnia 2018
Ten protokół ma na celu pokazanie, jak połączyć układy mikroelektrod in vitro z urządzeniami mikroprzepływowymi do badania transmisji potencjału czynnościowego w kulturach neuronalnych. Analiza danych, a mianowicie wykrywanie i charakteryzacja rozchodzących się potencjałów czynnościowych, odbywa się za pomocą nowego, zaawansowanego, a jednocześnie przyjaznego dla użytkownika i ogólnodostępnego narzędzia obliczeniowego.
Ogólnym celem tego protokołu jest pokazanie, w jaki sposób połączyć wykorzystanie mikrofluidyki z układami mikroelektrod w celu wygenerowania platformy odpowiedniej do badania komunikacji neuronalnej i propagacji sygnału aksonalnego. Cześć, nazywam się Paulo Aguiar i jestem kierownikiem naukowym Laboratorium Neuroinżynierii i Neuronauki Obliczeniowej w INEB, używanym do kodowania inżynierii biomedycznej na Uniwersytecie w Porto w Portugalii. Zrozumienie transmisji informacji w obwodach neurologicznych pozostaje jednym z największych wyzwań w neurobiologii.
Dzisiaj pokażę wam, w jaki sposób możemy połączyć indywidualne układy mikrosiłowników z mikrofluidyką i narzędziami programowymi opracowanymi w naszym laboratorium, aby wykrywać i charakteryzować propagujące potencjały czynnościowe. Używamy tego układu w różnych badaniach, a mianowicie w kodowaniu i dekodowaniu neuronalnym oraz w komunikacji między neuronami czuciowymi a innymi typami komórek. Uważamy, że wizualna demonstracja tego protokołu ma kluczowe znaczenie.
Ponieważ montaż układów mikrofluidycznych i mikroelektrod jest trudny w zarządzaniu i trudny do odtworzenia tylko poprzez odtwarzanie protokołów. Dla rynku sprzedaż kultywna na tej platformie nie jest prosta, jak w przypadku konwencjonalnych ABA, i wymaga szczególnej uwagi na rzeczy siedzące w komórkach i magnesy hodowlane. Ta konfiguracja pozwala nam badać kilka właściwości związanych z komunikacją, takich jak prędkość i kierunek propagacji, w dobrze kontrolowanym środowisku.
Choć procedura rejestracji jest prosta, analiza danych wymaga wiedzy i użycia odpowiednich narzędzi obliczeniowych. Dzień przed umieszczeniem ogniw zacznij od przygotowania urządzeń mikroprzepływowych, czyszcząc je taśmą winylową. Delikatnie dociśnij taśmę do urządzenia, aby dotrzeć do wszystkich obszarów mikrofluidyka.
Plazma powietrzna czyści MEA przez trzy minuty, aby oczyścić powierzchnię i uczynić ją bardziej hydrofilową. Wewnątrz okapu z przepływem laminarnym zanurz mikrofluidyki w 70 procentach etanolu. Pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu.
Umieść każdy MEA na szalce Petriego i sterylizuj przez 15 minut ekspozycji na światło UV. Następnie udaj się do centralnego obszaru MEA z 500 mikrolitrami roztworu PEI. Inkubować przez co najmniej godzinę.
Wewnątrz okapu z przepływem laminarnym odessać roztwór powłoki PEI z powierzchni MEA. Następnie umyj MEA cztery razy jednym mililitrem sterylnej wody. Za pomocą sterylnego mikroskopu, umieszczonego wewnątrz okapu z przepływem laminarnym.
Wyśrodkuj chip MEA i dodaj jeden mililitr sterylnej wody do centralnej części MEA. Następnie umieść urządzenie mikroprzepływowe na powierzchni MEA i ostrożnie wyrównaj mikro aktywną siatkę MEA z mikrorowkami. Zassać nadmiar wody i inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni, aby umożliwić pełne przyłączenie.
Następnego dnia załaduj studzienki lamininą i ponownie inkubuj. Po pobraniu zarodków należy przystąpić do wycięcia kory przedczołowej. Zacznij od ostrożnego odsłonięcia mózgu za pomocą kleszczy.
Następnie delikatnie wyjmij mózg z jego jamy. Przykryj zimnym H-HBSS. Jeśli są obecne, usuń i wyrzuć opuszki węchowe.
Na koniec przeanalizuj korę przedczołową. Upewnij się, że opony mózgowe zostały całkowicie usunięte. Powtórz tę procedurę dla obu półkul.
Dla liczby mózgów wymaganych do twojego badania. Wewnątrz okapu z przepływem laminarnym zbierz fragmenty kory uprzednio wypreparowane w sumie pięć mililitrów H-HBSS. Następnie przenieś te fragmenty do sterylnej 15-mililitrowej probówki przewlekłej.
Odpipetować pipetą i wlać 2,3 mililitra świeżo przygotowanego roztworu trypsyny do probówki zawierającej fragmenty kory mózgowej. Wymieszaj zawiesinę i inkubuj w temperaturze 37 stopni przez 15 minut. Mieszaj co pięć minut.
Następnie odrzucić supernatant zawierający trypsynę, dodać H-HBSS zawierający FBS, aby dezaktywować pozostałą trypsynę. Delikatnie poruszyć. Pozwól fragmentom kory osiąść i odrzuć supernatant.
Przemyć dwa razy H-HBSS w celu usunięcia FBS i ponownie wyrzucić supernatant. Dodaj uzupełnioną pożywkę neuronalną i mechanicznie dysocjuj tkanki, powoli pipetując w górę iw dół. Wyrzucić pozostałą tkankę, filtrując zawiesinę soli przez sitko do komórek.
Następnie wymieszaj 20 mikrolitrów zawiesiny komórkowej z 20 mikrolitrami błękitu trypanowego. Przenieś 10 mikrolitrów do komory Neubauera i policz liczbę żywotnych komórek. Bezpośrednio przed umieszczeniem w komórce usuń lamininę ze wszystkich studzienek mikro EF. Następnie dodać niewielką objętość pożywki sklarowanej nad osadem do każdej studzienki przedziału aksonalnego.
Powoli wysiewać pięć mikrolitrów zawiesiny komórkowej do komory somalnej. Inkubować w temperaturze 37 stopni przez godzinę, aby umożliwić przyczepienie się komórek do podłoża. Po godzinie delikatnie napełnij każdą studzienkę ciepłym uzupełnionym podłożem.
Dodaj małe objętości, aby uniknąć oderwania komórek. Następnie przenieś mikro EF do inkubatora. Tutaj pokazano posiew po pięciu dniach in vitro.
Po tygodniu kultury zaczynają wykazywać spontaniczną aktywność. Przed wykonaniem nagrań użyj regulatora temperatury, aby zjeść płytę podstawy ognia przed amp. Następnie umieść micro EF na przedwzmacniaczu, a następnie zamknij i zatrzaśnij pokrywę.
Aby nagrać, otwórz wielokanałowe oprogramowanie eksperymentalne. Ustaw częstotliwość próbkowania na 20 kiloherców. Przeciągnij pola filtru i nagrania, a następnie połącz je sekwencyjnie, aby zarejestrować zarówno dane nieprzetworzone, jak i filtrowane.
Rozpocznij akwizycję danych, aby zwizualizować sygnały i szybko nagrywać. Zarejestrowane dane można szybko eksplorować za pomocą analizatora wielokanałowego. Tutaj propagacja sygnału wzdłuż mikrorowków jest już wyraźna.
Aby zidentyfikować i scharakteryzować te rozprzestrzeniające się zdarzenia, otwórz swoje nagranie w programie micro spike hunter. Kliknij przycisk informacji o pliku, aby uzyskać dostęp do ustawień nagrywania, a następnie wybierz zestaw mikroelektrod do analizy. Ustaw próg propagacji wykrywania zdarzeń.
I szybki odczyt danych. Oprogramowanie wyświetli listę wszystkich wykrytych sekwencji. Użytkownik może następnie ocenić prędkość propagacji jako informację między parami mikroelektrod oraz na podstawie ich odległości między nimi i korelacji krzyżowej.
Narzędzie do wykresów chemii pozwala użytkownikowi ręcznie oszacować prędkość propagacji. Tutaj pokazane jest zdarzenie propagujące. Wykrywany wzdłuż czterech mikroelektrod w mikrorowku.
Zdarzenia te można przedstawić na wykresie Rassera. Oto aktywność propagacji wzdłuż 11 mikrorowków przez pierwsze dwie minuty nagrywania. Mikrorowek o wysokiej i niskiej aktywności jest kolorowany na żółto i czerwono, z szacunkiem.
Zwróć uwagę na synchronizację aktywności wzdłuż 11 mikrorowków. Synchronizacja jest niezależna od tempa aktywności. Widać to w różnicach w chwilowej szybkości wypalania dwóch mikrorowków.
Mikrorowki działają również jako aksonalne wzmacniacze sygnału, jak pokazano na wykresie pudełka i wąsów. Pokazaliśmy, jak połączyć mikrofluidykę z MEA i jak hodować na nich neurony. Ponadto, jak nagrywać i wydobywać znaczące dane z tych nagrań.
Mamy nadzieję, że ta demonstracja będzie przydatna dla twoich badań, dlaczego możesz chcieć badać komunikację w obwodach neuronowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia integrację macierzy mikroelektrod z urządzeniami mikroprzepływowymi w celu badania przesyłania potencjałów czynnościowych w kulturach neuronalnych. Podkreślono w nim znaczenie demonstracji wizualnej oraz zastosowanie intuicyjnego narzędzia obliczeniowego do analizy danych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Neuroinżynieria
- Elektrofizjologia
Wstęp
- Zrozumienie przesyłania informacji w obwodach neuronalnych stanowi jedno z głównych wyzwań neuronauki.
- Macierze mikroelektrod umożliwiają rejestrację aktywności elektrycznej neuronów.
- Urządzenia mikroprzepływowe pozwalają na precyzyjną kontrolę środowiska komórkowego.
- Połączenie tych technologii może usprawnić badanie komunikacji neuronalnej.
Cel badania
- Stworzenie platformy do badania komunikacji neuronalnej i propagacji sygnałów aksonalnych.
- Wykrywanie i charakterystyka propagujących potencjałów czynnościowych w kulturach neuronalnych.
- Ułatwienie badań nad kodowaniem i dekodowaniem sygnałów neuronalnych.
Zastosowane metody
- Integracja matryc mikroelektrod z urządzeniami mikroprzepływowymi.
- Wykorzystanie narzędzi programistycznych opracowanych do analizy danych.
- Wizualna demonstracja protokołu w celu zapewnienia przejrzystości.
- Zastosowanie w różnych badaniach z udziałem neuronów sensorycznych.
Główne wyniki
- Skuteczna detekcja i charakterystyka potencjałów czynnościowych.
- Pogłębione zrozumienie mechanizmów komunikacji neuronalnej.
- Wykazanie efektywności protokołu w zastosowaniach badawczych.
- Opracowanie intuicyjnego narzędzia obliczeniowego do analizy danych.
Wnioski
- Połączone zastosowanie macierzy mikroelektrod i mikroprzepływów jest skuteczne w badaniu aktywności neuronów.
- To podejście może przyczynić się do postępów w badaniach nad neuronauką i neuroinżynierią.
- Protokoły wizualne są niezbędne dla zapewnienia powtarzalności i zrozumienia procedur.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta mikrofluidyczna platforma MEA rozwiązuje kluczowy problem w poszukiwaniu leków w neuronauce: izolację propagacji sygnału aksonalnego od szumu somatycznego w kulturach neuronalnych. Umożliwiając długoterminowy zapis propagacji impulsów w wysokiej rozdzielczości z poprawionym stosunkiem sygnału do szumu, metoda ta wspomaga mechaniczne ograniczanie ryzyka w przypadku celów terapeutycznych zaangażowanych w neurodevelopment, neurodegenerację i neuroregenerację. Zapewnia ona pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkryć poprzez kwantyfikację fenotypów związanych z komunikacją, takich jak prędkość przewodzenia i wzorce wyładowań.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania leków i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez izolację sygnalizacji aksonalnej w celu wyjaśnienia komunikacji specyficznej dla danych szlaków w obwodach neuronalnych.
- Wartość operacyjna: Wspiera redukcję ryzyka biologicznego poprzez funkcjonalną walidację celów modulujących prędkość propagacji impulsów oraz błędy przewodzenia.
- Wartość prognostyczna: Ilościowo określa mechanizmy kodowania i anterogradnej transmisji impulsów, co pozwala na selekcję projektów w portfolio w oparciu o funkcjonalne zaangażowanie celu.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane, przedzielone kultury neuronalne do dalszej oceny związków przy kontrolowanym wyrównaniu aksonów i sprzężeniu z mikroelektrodami.
- Wyniki ilościowe: Dostarcza powtarzalne, wysokorozdzielcze pomiary prędkości propagacji, błędów przewodzenia oraz częstotliwości wyładowań w celu niezawodnego przesiewania związków.
- Skalowalność i ponowne wykorzystanie: Umożliwia standaryzację platformy w badaniach nad komunikacją neuronów sensorycznych i konfiguracjami kokultur, co wspiera przenaszalność analizy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Modeluje procesy neurorozwojowe i neurodegeneracyjne poprzez śledzenie propagacji sygnałów aksonalnych w ciągu wielu tygodni in vitro.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez kwantyfikację fenotypów komunikacyjnych istotnych dla dysfunkcji i naprawy obwodów neuronalnych.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Dostarcza podstaw do decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) dzięki obiektywnym miernikom potencjału neuroregeneracyjnego i wierności kodowania informacji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od testowania hipotez dotyczących punktów uchwytu po identyfikację związków wiodących, zapewniając funkcjonalne odczyty, które łączą przesiewy fenotypowe z walidacją mechanistyczną w układach neuronalnych.
- Biologia odkrywcza: Wspomaga wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyk biologicznych poprzez izolowanie wkładu aksonalnego w aktywność sieci w kontrolowanych mikrootoczeniach.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne kultury neuronalne ze zestandaryzowanymi odczytami elektrofizjologicznymi do oceny działania związków.
- Analityka: Umożliwia ilościowe porównanie warunków za pomocą pomiarów prędkości propagacji, błędów przewodzenia oraz częstotliwości wyładowań uzyskanych z analizy ciągów impulsów (spike trains).
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez modelowanie dynamiki komunikacji aksonalnej istotnej dla procesów neurodegeneracji i neuroregeneracji.
- Zastosowania instytucjonalne: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do badania komunikacji neuronów sensorycznych i systemów kokultur w wielu obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w propagacji sygnałów neuronalnych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność dzięki zastosowaniu kompartymentowego projektu hodowli oraz długoterminowej stabilności.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną minimalizację ryzyka w przypadku celów zaangażowanych w patologie o podłożu obwodowym.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dzięki mierzalnym fenotypom komunikacji aksonalnej powiązanym z mechanizmami chorobowymi.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obsłudze urządzeń mikrofluidycznych, hodowli neuronów oraz rejestracji elektrofizjologicznej.
- Zależność od dostępu do macierzy mikroelektrod, urządzeń do czyszczenia plazmowego, dygestoriów z laminarnym przepływem powietrza oraz systemów rejestracji z kontrolą temperatury.
- Konieczność standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia spójności w wyrównywaniu urządzeń, wysiewaniu komórek oraz protokołach wymiany pożywki.
- Konieczność uwzględnienia adaptacji przy rozszerzaniu metody na inne typy neuronów lub konfiguracje kokultur poza hodowle pochodzące z kory przedczołowej.
- Ograniczenia praktyczne obejmują złożoność techniczną montażu układów mikrofluidycznych z MEA oraz potrzebę zastosowania specjalistycznych narzędzi obliczeniowych do analizy propagacji potencjałów czynnościowych.
