Ustanowienie mikrobialnych kultur wzbogaconych eukariotów z chemicznie uwarstwionego jeziora antarktycznego oraz ocena potencjału wiązania węgla

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie kultur wzbogaconych protistów z antarktycznego jeziora Bonnie oraz pomiar fiksacji węgla jako wstępnego wskaźnika różnorodności metabolicznej. Cel ten osiąga się poprzez pobranie próbek wody z głębokości jeziora Bonnie odpowiadających znanym szczytom liczebności protistów i fitoplanktonu. Próbki wody jeziornej są następnie szczepione w różnych pożywkach wzrostowych i inkubowane w komorze wzrostowej wyposażonej w regulator temperatury i oświetlenie przez okres od czterech do sześciu tygodni.

Kultury można transportować w razie potrzeby w temperaturze 4 °C. Kolejnym krokiem jest wyekstrahowanie surowych lizatów komórkowych z kultur wzbogaconych. Ostatnim etapem tej procedury jest ocena potencjału wiązania węgla w lizacie komórkowym przy użyciu testu radioizotopowego na aktywność rybulozobisfosforanowej karboksylazy/oksygenazy, czyli RubisCO.

W rezultacie kultury wzbogaceń prokazotroficznych wykazują zróżnicowanie potencjału wiązania węgla w naturalnej społeczności protistów. Ta metoda może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące ekologii mikrobów w jeziorach. Przykładem jest rola eukariotycznych mikroorganizmów w cyklu węglowym na różnych etapach w stratyfikowanych jeziorach Antarktydy.

Chociaż pobieranie próbek z kolumny wody do kolejnych generacji kultur wzbogaconych jest często stosowaną techniką, niniejsza metoda zawiera modyfikacje pozwalające na pracę w ekstremalnie zimnym środowisku, w którym mogą wystąpić nieprzewidziane komplikacje. Pomysł na tę metodę pojawił się u mnie podczas poszukiwania sposobów na przetestowanie testu Redisco w naturalnych próbkach jeziornych. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy pobierania próbek są trudne do wyobrażenia, gdyż miejsca poboru znajdują się w środowisku obcym dla wielu badaczy.

Próbki są pobierane z jeziora Bonnie, jednego z wielu jezior trwale pokrytych lodem, znajdujących się w suchych dolinach McMurdo na Antarktydzie. Na jeden dzień przed pobraniem próbek z kolumny wody należy wybrać i przygotować miejsce poboru. Pozwoli to na ponowne uformowanie się warstw stratyfikacyjnych kolumny wody po zakłóceniach spowodowanych wierceniem i topnieniem lodu w otworze. Wyznacz lokalizację miejsca wiercenia za pomocą GPS, aby uzyskać dostęp do kolumny wody.

Rozpocznij od wywiercenia otworu w lodzie za pomocą świdra Jiffy Ice z dołączonym czterocalowym przedłużeniem Jiffy flight oraz odpowiednim wiertłem, aby zapobiec zamarznięciu świdra w otworze. Staraj się uniknąć wiercenia w wodzie ciekłej, zatrzymując proces wiercenia około czterech do sześciu cali nad lustrem wody. Otwór wiertniczy musi zostać poszerzony z średnicy sześciu cali do dwóch stóp w celu pobrania próbek.

Zostaje to osiągnięte przy użyciu urządzenia do wytapiania otworów w modelu gorzego morza, które tłoczy podgrzany glikol polietylenowy przez miedzianą rurkę. Proces wytapiania trwa zazwyczaj do 18 godzin i jest przeprowadzany w dniu poprzedzającym pobieranie próbek z kolumny wody. Należy upewnić się, że cały wymagany sprzęt oraz naczynia do przechowywania próbek znajdują się w miejscu poboru.

Materiały do pobierania próbek obejmują butlę NICU o pojemności od pięciu do 10 litrów, wciągarkę z kablem skalibrowanym pod kątem głębokości, odpowiednią liczbę butelek na próbki dla każdej głębokości poboru, ciężarek przekaźnikowy (messenger) oraz lodówki do transportu próbek. Pobieranie próbek należy rozpocząć wcześnie rano, około godziny 5:00, ponieważ filtrowanie wody jeziornej powinno zostać zakończone w dniu poboru. Do pobierania próbek należy użyć czerpaka Kin przymocowanego do skalibrowanej ręcznej wciągarki.

Pobierz próbki wody o objętości od jednego do pięciu litrów z głębokości wybranych na potrzeby niniejszego badania. Głębokości poboru próbek wynoszą sześć metrów, 15 metrów i 18 metrów, mierzone od symetrycznego poziomu wody PI w otworze lodowym. Próbki jeziora przechowuj w chłodniach i transportuj z miejsca poboru do laboratorium polowego.

Próbki pobrane za pomocą sań przymocowanych do ATv należy przetworzyć lub ustabilizować w polowym laboratorium. Bezpośrednio po pobraniu próbek, po ich transporcie do laboratorium polowego, należy rozpocząć hodowlę kultur wzbogaconych. Skoncentrować od 0,5 do 1 litra wody jeziornej na filtrze o średnicy 47 mm i rozmiarze porów 0,45 µm.

Filtry z polietersulfonu w procesie łagodnej filtracji. Jeśli wymagana jest analiza różnorodności zbiorności naturalnej, przefiltruj drugą próbkę na filtr o średnicy 47 mm i rozmiarze porów 0,45 µm.

Filtry z polietersulfonu zamrażamy błyskawicznie w ciekłym azocie. Każdy filtr przenosimy do sterylnej probówki typu Falcon o pojemności 50 ml zawierającej około 20 ml przefiltrowanej wody jeziornej, pobranej z tej samej głębokości co próbka na filtrze.

Przenieś zawiesinę komórkową do sterylnej kolby do hodowli komórek o przekroju 25 cm w celu namnażania na różnych pożywkach. Przygotuj wiele powtórzeń dla każdej głębokości pobierania próbek. Uzupełnij każdą kolbę hodowlaną o 50 x sterylne roztwory następujących pożywek: bold basil medium, BG 11 oraz F two.

Jeśli wymagana jest hodowla organizmów miksotroficznych, należy przygotować dwa naczynia uzupełnione pożywką F/2 i dodać dwa do trzech ziaren sterylnego ryżu do jednej z kolb z kulturą, a następnie inkubować w inkubatorze wzrostowym z kontrolą temperatury, w niskiej temperaturze i przy mniejszym natężeniu promieniowania przez co najmniej cztery tygodnie przed wysyłką do laboratorium w USA. Przenieś kultury wzbogacone do sterylnych probówek Falcon o pojemności 50 ml. W zgłoszeniu wysyłkowym wysuń wymagania dotyczące transportu: nie zamrażać i przechowywać w chłodzie. Po dotarciu do USA przenieś 5 ml każdej kultury wzbogaconej do 45 ml odpowiedniej pożywki wzrostowej w naczyniu o pojemności 125 ml.

Sterylna kolba Erlenmeyera zamknięta sterylną gąbką. Przechowując kultury wzbogacone jako kultury stacjonarne w komorze wzrostowej o kontrolowanej temperaturze 4 °C, przenosić kultury do świeżych mediów co 30 dni. Aby rozpocząć procedurę ekstrakcji lizatu komórkowego, przefiltrować 5 l kultury wzbogaconej na filtr Watman GF/F o średnicy 25 mm przy użyciu delikatnej próżni.

Następnie przetnij filtr na cztery lub pięć części za pomocą sterylnych stalowych nożyczek. Potem za pomocą sterylnej pęsety przenieś fragmenty do probówki z nakrętką o pojemności 2 ml, wypełnionej w jednej piątej objętości 0,1 mm średnicy.

Kuleczki cyrkonio-krzemianowe. Do probówki dodać 1,25 milliliters buforu do ekstrakcji filtracyjnej, a następnie przeprowadzić lizę komórek w mini homogenizatorze kuleczkowym przez 30 seconds przy ustawieniu prędkości 48, po czym inkubować na lodzie przez jedną minutę. Powtórzyć proces homogenizacji kuleczkowej jeszcze dwukrotnie, stosując jednominutowe inkubacje na lodzie pomiędzy cyklami, aby zapobiec przegrzaniu próbki w wirówce.

Odwirować zawiesinę przez dwie minuty przy 3000 ×g w temperaturze 4 °C, aby utworzyć luźny pellet włókien filtra GFF i szczątków ścian komórkowych. Pobrać 200 µl osadu i zanurzyć w 800 µl lodowatego 90% acetonu.

Przenieś pozostały supernatant do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra. Zmierz ilość ekstrahowalnego chlorofilu A w spektrofotometrze przy długościach fali 664 nanometrów i 647 nanometrów. Odwiruj pozostały supernatant przez dwie minuty przy 15 000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przenieś S do czystej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra, unikając pobrania osadu z nierozpuszczalnych błon komórkowych oraz pozostałych włókien filtra GFF. Ten rozpuszczalny lizat komórkowy może teraz zostać wykorzystany w teście aktywności rubisko karboksylazy, który zostanie zaprezentowany w dalszej części. Aby rozpocząć ten test, przenieś 125 µL każdego rozpuszczalnego lizatu do probówki do mikrocentryfugi z nakrętką o pojemności 1,5 ml, która została schłodzona na lodzie.

W przypadku próbek kontrolnych negatywnych, do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml z nakrętką należy dodać 125 µl rozpuszczalnego lizatu, pomijając dodanie substratu. Następnie przeprowadzić reakcje w dubletach dla wszystkich próbek oraz kontroli negatywnych. Przygotować 10 ml świeżego buforu do analizy i schłodzić go na lodzie.

Wlej do probówki o pojemności pięciu mililitrów odpowiednią ilość buforu do testu dla wszystkich próbek oraz kontroli negatywnych. Od tego momentu wszystkie kolejne kroki muszą być wykonywane pod wyciągiem chemicznym. Dodaj do przygotowanego buforu wodorowęglan sodu znakowany C 14 i przechowuj bufor w lodzie.

Pobrać 10 µL buforu do analizy zawierającego C 14 i rozcieńczyć go w jednym mililitrze buforu do analizy, odwracając probówkę w celu wymieszania. Dodać 100 µL rozcieńczonej mieszaniny do trzech mililitrów koktajlu scyntylacyjnego Bios Safe 2 w fiolce scyntylacyjnej i odwrócić, aby wymieszać. Zmierzyć liczbę zliczeń C 14 za pomocą licznika Beckman LS 6, 500; przed kontynuowaniem analizy liczba zliczeń powinna przekraczać 18 000 zliczeń na minutę.

Po dodaniu odpowiedniej ilości wodorowęglanu sodu znakowanego C 14 do buforu do analizy, przenieś probówki z reakcją do bloku grzewczego ustawionego na 25 °C i inkubuj przez trzy do pięciu minut. Następnie dodaj 100 µL buforu do analizy do lizatów i inkubuj w temperaturze 25 °C przez pięć minut. Po pięciu minutach dodaj rybulozobisfosforan do każdej próbki i pozostaw reakcję na pięć do 10 minut w temperaturze 25 °C.

Aby zatrzymać reakcję, należy dodać 100 µL 100% kwasu probiotycznego, a następnie wirować przez jedną godzinę przy 2000 ×g w celu usunięcia niewprowadzonego C 14. Na koniec całą objętość próbek należy przenieść do fiolek scyntylacyjnych zawierających trzy ml bios. Safe 2 koktajlu do zliczania scyntylacyjnego, aby określić liczbę impulsów na minutę w próbce stabilnej z kwasem.

Produkty końcowe określono za pomocą zliczania scyntylacyjnego. Do izolacji nowych, przystosowanych do zimna protistów fototroficznych i miksotroficznych z antarktycznego jeziora Bonnie na trzech głębokościach zastosowano hodowle wzbogacone. Aby wyselekcjonować większą różnorodność organizmów, wykorzystano różne rodzaje pożywek wzrostowych: pożywkę Bolds, pożywkę BBMF dwa si, pożywkę morską oraz pożywkę BG 11.

Stężenie składników odżywczych oraz promieniowanie aktywnie syntetyzujące lub PAR przedstawione w tej tabeli odzwierciedlają warunki panujące w momencie pobierania próbek. Inspekcja wizualna kultur wzbogaconych za pomocą mikroskopii świetlnej wykazała, że w kulturach dominowały protisty fototroficzne, o czym świadczyła obecność pigmentu chlorofilu w większości komórek. Kultury zawierały również różnorodne morfologie komórek, zależnie od głębokości pobrania inokulum oraz rodzaju pożywki zastosowanej w hodowli.

Maksymalne szybkości aktywności karboksylazy katalizowanej przez enzym rubis były mierzone w kulturach wzbogaconych jako wskaźnik wiązania węgla. Monitorowano również zawartość chlorofilu a jako szacunek biomasy protistów fototroficznych, co przedstawiono tutaj.

Pomimo hodowli wszystkich kultur w tej samej temperaturze, potencjał wiązania węgla i biomasa fototroficzna różniły się znacznie pomiędzy kulturami wzbogaconymi, mimo zastosowania tego samego reżimu oświetleniowego. Maksymalna aktywność rubis O zaobserwowana była w kulturach wzbogaconych cztery i sześć hodowanych na pożywce BBM oraz w kulturach wzbogaconych 13 i 14 hodowanych na pożywce BG 11. W przeciwieństwie do nich, kultury 1921 i 23 wzbogacone na pożywce wzrostowej F dwa wykazały maksymalne aktywności karboksylazy, które były od 4 do 34 razy niższe.

Różnice te nie wynikały z niższego poziomu biomasy w dwóch kulturach F, ponieważ aktywność karboksylazy wyrażono w odniesieniu do zawartości chlorofilu a. Co więcej, analiza korelacji Pearsona wykazała, że aktywność RubisCO nie korelowała z koncentracją chlorofilu a. Kultury BBM zaszczepiono wodą jeziorną pobraną z głębokości sześciu metrów oraz 15 metrów.

Kultura wzbogacona nr 5 wykazywała najwyższe poziomy chlorofilu A, podczas gdy wszystkie pozostałe kultury charakteryzowały się stosunkowo niską zawartością chlorofilu a, niezależnie od aktywności enzymu RubisCO. Po opanowaniu techniki, pobieranie próbek z jeziora zajmuje około dwóch godzin. W zależności od liczby pobranych próbek, analizę aktywności karboksylazy przeprowadza się również w ciągu dwóch godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak analiza aktywności enzymów heterotroficznych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. na jakiej głębokości występują heterotrofy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat sposobu pobierania próbek z jeziora, ich wzbogacania oraz oznaczania aktywności karboksylazy RubisCO.