Reakcja łańcuchowa polimerazy: podstawowy protokół oraz strategie rozwiązywania problemów i optymalizacji

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie etapów reakcji łańcuchowej polimerazy, czyli PCR, która służy do wytworzenia znacznej ilości konkretnego fragmentu DNA z niewielkiej ilości materiału wyjściowego. Najpierw należy przygotować odczynniki i materiały niezbędne do przeprowadzenia reakcji PCR, a następnie sporządzić mieszaninę reakcyjną, zawierającą cztery deinoksyrybonukleotydy, matrycę DNA, primery oraz polimerazę DNA. Następnie należy zaprogramować warunki cykli termicznych i przeprowadzić reakcję PCR.

Następnie należy sprawdzić wyniki, aby ustalić, czy reakcja przebiegła pomyślnie. W rezultacie reakcja łańcuchowa polimerazy powinna przynieść specyficzny amplikon o pożądanej wielkości produktu.

Zazwyczaj osoby po raz pierwszy stosujące ten protokół mogą mieć pewne trudności z obliczeniem ilości każdego z odczynników zmiennych, a czasem z samym pipetowaniem właściwych objętości, zwłaszcza w przypadku polimerazy zawierającej glicerol. Doświadczenie należy rozpocząć od przygotowania świeżo napełnionego wiaderka z lodem. Należy nosić rękawiczki, aby uniknąć zanieczyszczenia reakcji.

Mieszanina i odczynniki. Przygotować komponenty PCR na lodzie do całkowitego rozmrożenia. Należą do nich primery do matrycy DNA, polimeraza DNA, 10x bufor reakcyjny z chlorkiem magnezu lub bez niego, deoksynukleotydy, sterylna woda oraz chlorek magnezu.

Chlorek magnezu jest wymagany w przypadku stosowania buforu bez chlorku magnezu. Umieść płytkę 96-dołkową w wiaderku z lodem, aby służyła jako uchwyt dla probówek PCR o cienkich ściankach o pojemności 0,2 ml. Następnie przygotuj na stole roboczym probówki PCR i zakrętki.

Statyw na probówki do PCR, marker odporny na etanol oraz zestaw mikropipet. Zawsze należy przygotować tabelę odczynników szczegółowo opisującą mieszaninę reakcyjną z odpowiednią ilością sterylnej wody destylowanej w celu uzyskania końcowej objętości 50 µL. Na przykład, stosując 5 µL buforu bez magnezu, 1 µL 10 mM dNTP oraz zoptymalizowane 4,0 mM magnezu.

Jeden µL każdego z 20 µM starterów, 0,5 µL matrycy o stężeniu 2 ng/µL oraz 0,5 µL polimerazy wymagają dodania 33 µL samej sterylnej wody. Należy dodać chlorek magnezu, jeśli nie znajduje się on w buforze 10x lub jeśli jest on wymagany do optymalizacji PCR.

Należy opisać probówki do PCR markerem odpornym na etanol, przypisując etykietę do każdej probówki z reakcją. Najpierw dodaj obliczone ilości sterylnej wody, a następnie dodaj bufor 10 x oraz DN NTPs 10 millimolar. W tej reakcji przeprowadzamy miareczkowanie chlorkiem magnezu.

Ponieważ stężenie magnezu nie będzie stałe, do poszczególnych probówek PCR dodaje się osobno chlorek magnezu, a objętość uzupełnia się do 10 µl sterylną wodą, tak aby do każdej probówki PCR dodać 40 µl końcowego master mixu. Aby dopełnić 50 µl reakcji i chlorek magnezu, należy następnie dodać matrycę DNA oraz primery. Na koniec do probówki mikrocentryfużowej o pojemności 1,8 ml dodaje się od 0,5 do 2,5 jednostek polimerazy DNA na 50 µl reakcji.

Przygotuj roztwór master mix w ilości wystarczającej dla próbek kontrolnych oraz z uwzględnieniem strat podczas przenoszenia pipetą. Ustaw mikropipetę na objętość wynoszącą około połowy całkowitej objętości roztworu i delikatnie wymieszaj poprzez pipetowanie. Do każdej próbki testowej odnieś odpowiednią ilość master mix do probówki PCR.

W przypadku kontroli negatywnej bez matrycy DNA, należy dodać wszystkie odczynniki i użyć sterylnej wody w celu zrekompensowania brakującej objętości DNA. Następnie, dla kontroli pozytywnej, należy zastosować zestaw matrycy DNA i starterów, które amplifikują znany fragment w tych samych warunkach, co eksperymentalne próbki PCR. Termocyklery do PCR szybko nagrzewają i chłodzą mieszaninę reakcyjną, co umożliwia indukowaną ciepłem denaturację dupleksu, przyłączanie starterów do nici plus i minus matrycy DNA oraz elongację produktu PCR.

Czasy cykli opierają się na wielkości matrycy oraz zawartości GC w DNA zgodnie z ogólną formułą. Rozpocznij od wstępnej denaturacji matrycy, a następnie przeprowadź od 25 do 35 rund trzystopniowego programu cykli temperaturowych. Pierwszym krokiem tych cykli jest denaturacja matrycy DNA.

Następnie zaprogramuj optymalną temperaturę przyłączania starterów, wynoszącą około pięciu stopni Celsiusz poniżej pozornej temperatury topnienia starterów, po której następuje etap elongacji, aby doprowadzić polimerazę do matrycy DNA i zsyntetyzować produkt PCR. Teraz wprowadź liczbę cykli. Następnie zaprogramuj.

Przedłużony etap elongacji w celu całkowitego przeprowadzenia syntezy amplikonów. Na koniec należy wprowadzić etap terminacji, schładzając mieszaninę do czterech stopni Celsiusjusza. Jeśli standardowe warunki PCR nie pozwalają na otrzymanie pożądanego amplikonu, konieczna jest optymalizacja PCR w celu uzyskania lepszych wyników.

W przypadku, gdy reakcje nie powiodły się za pierwszym razem, należy podjąć próbę rozwiązania problemu. W pierwszej kolejności należy upewnić się, że przyczyną nie był błąd ludzki. Może to wystąpić w razie błędu podczas pipetowania lub jeśli pominięto dodanie odczynnika do jednej z probówek.

Następnie można spróbować zmienić niektóre parametry rygorystyczności warunków, aby zmodyfikować ustawienia termocyklera, lub alternatywnie zmienić stężenie magnezu. W celu rozwiązania problemów można również spróbować dodać do odczynników odpowiednie dodatki. Innym rozwiązaniem jest rozważenie PCR z gorącym startem (hot start PCR) jako wszechstronnej modyfikacji, w której znacznie wydłużany jest czas począgłej denaturacji.

Następnie zastosowano elektroforezę w żelu AROS w celu rozdzielenia produktów PCR genu GAL trzech z genomowego DNA S seia, aby określić optymalne stężenie jonów magnezu dla tego zestawu odczynników; zauważono, że produkt PCR o oczekiwanym rozmiarze 2098 par zasad pojawia się począwszy od stężenia magnezu 2,5 millimolar, przy czym stężenie optymalne wynosi cztery millimolar. W przypadku amplifikacji pożądanego produktu PCR z różnych matryc DNA jako wyraźnego prążka, wymagane jest stężenie magnezu 2 millimolar. Zmniejszenie rygorystyczności reakcji do warunków efektywnie suboptymalnych dla amplifikacji powoduje powstanie smug produktów nieswoistych.

Ponadto, dzięki ogólnemu zmniejszeniu rygoryzmu reakcji, do utworzenia amplikonu wymagana jest mniejsza ilość jonów magnezu. W związku z tym optymalizacja PCR przy uwzględnieniu wszystkich zmiennych może pozwolić na uzyskanie konkretnego, pożądanego produktu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować i przeprowadzić reakcję łańcuchową polimerazy.

Celem jest zrozumienie zmiennych każdego procesu PCR oraz sposobów ich manipulowania w celu uzyskania pożądanego amplikonu.