Dostosowanie morfologii Aspergillus niger poprzez dodanie mikrocząsteczek talku

Metoda ta służy do generowania i charakteryzowania struktur morfologicznych grzyba nitkowatego Aspergillus niger zależnych od mikrocząsteczek, aby powiązać morfologię grzyba z wydajnością. Hodowlę A. niger prowadzi się z dodatkiem lub bez dodatku mikrocząsteczek w trzymilitrowym bioreaktorze z mieszadłem przez 72 h w celu obliczenia wydajności właściwej. Próbki pobiera się w określonych punktach czasowych, a następnie określa masę suchą biomasy oraz aktywność betaglukuronidazy.

Po 72 godzinach należy zbadać morfologię grzyba za pomocą mikroskopii i scharakteryzować ją poprzez cyfrową analizę obrazu. Następnie odpowiednie parametry analizy obrazu należy połączyć w liczbę morfologiczną, która jest matematycznie skorelowana z wydajnością specyficzną. Ostatecznie metoda ta pozwala na precyzyjne generowanie i kompleksową charakterystykę morfologii aspergillus Niger w celu lepszego zrozumienia morfogenezy mikroorganizmów nitkowatych.

Aspergillus niger jest od wielu dziesięcioleci ważnym organizmem przemysłowym wykorzystywanym w biotechnologii. Jedną z najbardziej intrygujących i często niekontrolowanych cech Aspergillus niger oraz gatunków pokrewnych jest ich złożona morfologia, która w zależności od warunków hodowli przybiera formę od gęstych sferycznych granulek po lepkie grzybnie. Główną zaletą naszej procedury jest to, że dzięki dodaniu mikrocząsteczek jesteśmy teraz w stanie dostosować morfologię grzyba konkretnie do potrzeb procesu.

Do tej pory nie opisano żadnej innej metody umożliwiającej taką modyfikację morfologii grzybów. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące hodowli mikroorganizmów nitkowatych. W zastosowaniach przemysłowych kluczowe jest bowiem kontrolowanie morfologii grzybów, a także rozróżnianie morfologii o wysokiej i niskiej wydajności produkcji.

Nasz protokół umożliwia pożądaną modyfikację i charakterystykę morfologii grzybów. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat morfologii Aspergillus niger, można ją również zastosować do innych mikroorganizmów nitkowatych, takich jak szczepy Penicillium lub Streptomyces. Przygotuj cztery bioreaktory do hodowli sterylnych zgodnie ze szczegółami zawartymi w towarzyszącym protokole.

Tekst oparty na dodawaniu mikrocząsteczek, hodowli Aspergillus niger o różnej morfologii. Po 72 godzinach przenieść 50 ml próbek cieczy hodowlanej do probówki typu Falcon.

Próbki biomasy należy pobrać co najmniej w dwóch powtórzeniach. Po wysuszeniu w deskrykatorze należy zważyć filtr celulozowy za pomocą wagi analitycznej. Filtr umieścić w lejku Buchnera podłączonym do pompy próżniowej z odnośnikiem wodnym. Przefiltrować 10 mililitrów próbki, a następnie 10 mililitrów wody dejonizowanej w celu usunięcia składników pożywki z biomasy. Filtr należy raz złożyć na pół.

Umieścić próbkę w szklanej szalce Petri i włożyć do suszarki komorowej aż do uzyskania stałej masy. Przenieść filtr do eksykatora i pozostawić do wystygnięcia. Następnie zmierzyć masę.

Oblicz suchą masę biomasy na litr poprzez wyznaczenie masy, obliczenie różnicy wag filtrów i następujące dzielenie przez objętość próbki dla analiz enzymatycznych oksydazy glukozowej i peroksydazy. Próbki przechowuj w lodzie, korzystając ze strzykawki o pojemności 1,5 ml. Zawiesinę hodowlaną przepuść przez filtr z octanu celulozy do probówki reakcyjnej w celu wykonania analizy beta-frukto SASE.

Aby zapewnić dokładność i statystyczną istotność wyników, analizę przeprowadzamy w dwóch powtórzeniach trzykrotnych. W celu rozpoczęcia testu, do probówki dodaje się 20 µL próbki; aby kontrolować zależny od pH i temperatury rozkład sacharozy do glukozy, zamiast 20 µL próbki należy użyć 20 µL wody dejonizowanej. Ponadto dla każdej próbki należy przygotować kontrolę negatywną w celu oznaczenia pozostałej glukozy w pożywce hodowlanej.

20 µL próbki inaktywowanej termicznie. Aby zainicjować reakcję przekształcenia sacharozy w glukozę, dodać 200 µL 1,65 M roztworu sacharozy. Przy pH 5,4 do 20 µL próbki inkubować wszystkie probówki z reakcją w bloku grzewczym o temperaturze 40 °C przez 20 minut. Przerwać reakcję poprzez ogrzewanie w temperaturze 95 °C przez 10 minut, po uprzednim schłodzeniu probówek na lodzie.

W razie potrzeby odwiruj próbki, a następnie rozcieńcz je przed analizą tak, aby zmierzona absorbancja mieściła się w zakresie wartości kalibracyjnych. Następnie do każdego dołka płytki mikrotitracyjnej dodaj 2 µL próbki. Pomiary próbek wykonaj w trzech powtórzeniach.

Należy również przygotować krzywą wzorcową dla 10 roztworów glukozy o stężeniach od 1 mM do 15 mM. W celu kalibracji punktu zero należy użyć 2 µL wody dejonizowanej. Następnie do każdej próbki należy dodać 200 µL roztworu odczynnika.

Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Zmierzyć absorbancję przy 450 nanometrach, używając czytnika mikropłytek Sunrise 96-dołkowego oraz oprogramowania do pobierania danych Magellan. Otworzyć wykres wyników w arkuszu kalkulacyjnym i wyznaczyć krzywą kalibracyjną standardu.

Oblicz aktywność dla każdej próbki. Następnie wyznacz aktywność beta-fruktozydazy, odejmując wartości odpowiedniej kontroli negatywnej od aktywności próbki. Na koniec oblicz specyficzną produktywność, uwzględniając suchą masę biomasy oraz aktywność beta-fruktozydazy.

Należy przenieść 3 mL zawiesiny hodowlanej do plastikowej szalki Petriego i rozcieńczyć ją fizjologicznym roztworem chlorku sodu, aby oddzielić od siebie struktury morfologiczne. Jakość zdjęć mikroskopowych ma wyjątkowe znaczenie. Ze względu na późniejszą analizę obrazu, podczas etapu rozcieńczania należy zachować szczególną staranność.

Umieść szalkę Petriego pod mikroskopem wyposażonym w zintegrowaną kamerę. Należy wykonać i zapisać około 100 obrazów struktur morfologicznych dla każdej próbki, dbając o to, aby na każdym zdjęciu przynajmniej jeden obiekt był widoczny w całości. Postępuj w ten sam sposób z szalkami zawierającymi próbki z różnych reaktorów, wykonując nowe zdjęcia dla każdego z nich.

Zwróć uwagę na różnice w morfologii wzrostu próbek z różnych reaktorów, hodowanych z różną ilością dodanego proszku talkowego. Następnie otwórz wszystkie obrazy tej samej próbki w programie do przetwarzania obrazów Image J. Używając narzędzia procesu, przekształć obrazy w binaryjne.

Konwertuj obrazy na czarno-białe, aby zastosować tę operację do całej serii zdjęć. Następnie użyj kodu makra i otwórz jedno z obrazów zawierających pasek skali. Poprowadź linię prostą wzdłuż paska skali, aby określić liczbę pikseli odpowiadającą 2000 mikronów.

Wybierz narzędzie analizy, ustaw pomiar i wybierz czynniki kształtu: wymiary ferreta, średnicę, pole oraz obwód. Użyj makra do przetworzenia serii obrazów. Następnie otwórz arkusz kalkulacyjny zawierający zestawienie wyników wartości czynników kształtu.

Dla każdego obrazu, obejmującego wszystkie obrazy jednej próbki, oblicz wartość parametru morfologicznego. Oblicz średnią wartość parametru morfologicznego. Użyj programu do tworzenia wykresów i analizy danych, aby nanieść parametr morfologiczny w funkcji specyficznej wydajności.

Wyznacz zależność matematyczną za pomocą regresji matematycznej poprzez dodawanie rosnących stężeń mikrocząsteczek talku. Osiem Niger SKAN 10 15. Morfologia zmienia się z typowej morfologii granulatu na morfologię rozproszoną lub nawet grzybkową, podczas gdy w warunkach standardowych występuje oczekiwana morfologia granulatu.

Interesujące jest to, że morfologia grzybni jest kształtowana poprzez suplementację pożywki mikrocząsteczkami talku w stężeniu 10 g/l. Jednocześnie aktywność Beto Fructotazy wzrasta około trzykrotnie; suplementacja proszkiem talkowym w stężeniu jednego lub trzech g/l prowadzi do uzyskania morfologii rozproszonej z dwukrotnie wyższą aktywnością fruktozową, przy zastosowaniu parametrów określonych w automatycznej analizie obrazu. Morfologia zależna od mikrocząsteczek może zostać kompleksowo opisana za pomocą morfologii.

Należy zauważyć, że idealnie okrągłe, gładkie granulki na obrazach mikroskopowych będą wyglądać jak idealne koła dla takich cząstek. Liczba morfologiczna w warunkach standardowych przyjmuje wartość zbliżoną do jedności. Morfologia w reaktorze pierwszym wykazuje liczbę morfologiczną w okolicy 0,8.

Morfologia w reaktorze czwartym przy stężeniu 10 g/L. Proszek talkowy charakteryzuje się liczbą morfologii wynoszącą około 0,1. Liczba morfologii dla reaktorów drugiego i trzeciego przy stężeniach proszku talkowego wynoszących odpowiednio 1 i 3 g/L mieści się pomiędzy tymi wartościami ekstremalnymi, co wskazuje na morfologię rozproszoną.

Ponieważ morfologia zależna od mikrocząsteczek jest ściśle powiązana z produktywnością beta-fruktozylanów, istnieje dobra korelacja matematyczna między morfologią, liczbą a produktywnością po jej rozwoju. Technika ta otworzyła badaczom w dziedzinie biotechnologii drogę do dalszego zgłębiania morfologii grzybów, a w szczególności jej związku z produktywnością. Dzięki zastosowaniu tej procedury szczegółowego tworzenia specyficznych morfologicznych krzyżówek grzybów można badać inne istotne aspekty hodowli mikroorganizmów nitkowatych.

Wiadomo na przykład, że morfologia grzybni jest znacznie bardziej lepka niż morfologia podniebienna. W konsekwencji ogólna wydajność procesu jest ograniczona przez problemy z oczyszczaniem pożądanego produktu. Nasza liczba morfologiczna pomoże w opracowaniu modeli dotyczących hodowli i protokołów oraz pogłębi nasze zrozumienie morfologii grzybów w ujęciu ogólnym.