Wykrywanie oddziaływań nanocząstek fluorescencyjnych z pierwotnymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej
28 marca 2014
Analiza interakcji nanocząsteczek z określonymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej.
Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie interakcji nanocząstek fluorescencyjnych z pierwotnymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej. Osiąga się to poprzez uprzednie potraktowanie interesujących komórek nanocząstkami. W kolejnym kroku komórki są znakowane przeciwciałem przeciwko specyficznym dla komórki markerom powierzchniowym, a następnie analizowane za pomocą cytometrii przepływowej.
Ostatecznie można zmierzyć interakcję nanocząstek z poszczególnymi populacjami komórek odpornościowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia, jest to, że dzięki tej technice zmiany intensywności fluorescencji wywołane przez nanocząstki można określić ilościowo w nieprzylegających populacjach komórek W przypadku internalizacji nanocząstek w leukocytach krwi lub oczyszczonych monocytach należy rozpocząć od posiewu pięć razy 10 do jednej piątej komórek będących przedmiotem zainteresowania w jednym mililitrze na studzienkę. W każdym dołku 12-dołkowej płytki.
Następnie dodać 10 mikrolitrów świeżo przygotowanej roboczej zawiesiny nanocząstek fluorescencyjnego dwutlenku krzemu do każdej studzienki doświadczalnej, dodając równą objętość kompletnego podłoża do niepoddanych działaniu substancji studzienek kontrolnych również w tym czasie. Po godzinnej internalizacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza, przenieś próbki do pojedynczych 1,5 mililitrowych probówek polipropylenowych, a następnie wiruj próbki przez trzy minuty w temperaturze 6 000 razy G i temperaturze pokojowej, aby zabarwić komórki CD 14 za pomocą niebieskiej inkubacji 100 mikrolitrów każdej zawiesiny komórkowej w 10 mikrolitrach ludzkiego przeciwciała w stosunku jeden do 11 w buforze przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wypłukaniu niezwiązanego przeciwciała w jednym mililitrze biegnącego buforu, ponownie zawieś komórki w 200 mikrolitrach świeżego buforu do analizy cytometrii przepływowej.
Następnie, aby skonfigurować spektralną kompensację rozlewania się, otwórz pole ustawień przyrządu w oprogramowaniu do cytometrii przepływowej, a następnie pobierz nieznakowaną próbkę wolną od nanocząstek przeciwciała przy niskiej prędkości płynu. Dostosowanie ustawień kompensacji w obecności fluorescencyjnych nanocząstek jest najtrudniejszą częścią procedury, ponieważ nanocząstki mogą zakłócać rozpraszanie boczne, aby zapewnić sukces, należy zdefiniować bramkę interesującej populacji komórek Ręcznie dostosuj rozpraszanie do przodu i na bok, regulując kanały napięcia. Następnie narysuj odpowiednio dużą bramę wokół żądanej populacji komórek.
Załaduj kolejną nieoznakowaną próbkę i otwórz kartę kompensacji w polu ustawień urządzenia. Dostosuj współczynnik kompensacji podczas akwizycji, aż intensywność fluorescencji w kanale rozlewowym będzie mniej więcej taka sama dla populacji fluorochromu dodatniego i ujemnego. Na koniec, po dostosowaniu kompensacji dla każdej pojedynczej barwionej probówki kontrolnej fluorochromu, odczytaj próbki poddane działaniu nanocząstek, aby lepiej scharakteryzować zachowanie białych krwinek w odpowiedzi na nanocząstki, przeprowadzono testy internalizacji, jak właśnie wykazano.
Na przykład w tym reprezentatywnym eksperymencie trzy główne subpopulacje leukocytów krwi zostały wyraźnie zidentyfikowane przez rozpraszanie do przodu i na bok po izolacji PBMC. Co więcej, po leczeniu dwutlenkiem krzemu fz, limfocyty, monocyty i granulocyty wykazywały różne szybkości internalizacji nanocząstek, na co wskazuje ich intensywność fluorescencji. Na tych obrazach wykazano internalizację nanocząstek w pierwotnych monocytach CD 14 dodatnich oczyszczonych z pbmc.
Te wykresy rozrzutu pokazują monocyty CD 14 dodatnie w obecności nanocząstek dwutlenku krzemu Fitza. Histogram ilustruje kwantyfikację komórek fitzy dodatnich wyrażoną jako intensywność fluorescencji. Podobne eksperymenty internalizacji przeprowadzono z monocytami TP one traktowanymi rosnącymi stężeniami nanocząstek dwutlenku krzemu Fitza z nieleczonymi komórkami jako kontrolą negatywną.
Wykresy kropkowe ilustrują zależny od dawki wzrost rozpraszania bocznego z niezmienionym rozpraszaniem do przodu w jednej linii komórkowej TP po internalizacji nanocząstek. Dane z tych wykresów sugerują, że leczenie nanocząstkami dwutlenku krzemu Fitza indukuje zależną od dawki internalizację w monocytach, podkreśloną przez zwiększenie ziarnistości wewnątrzkomórkowej Aby uzyskać dalszy wgląd w interakcje między komórkami odpornościowymi a nanocząstkami, mikroglej hodowano przez siedem dni in vitro i inkubowano z nanocząstkami przez godzinę. Mikroskopia fluorescencyjna wykazała mieszaną hodowlę pierwotnych komórek glejowych z dużą liczbą nieprzylegających astrocytów GFP ujemnych i niektórymi komórkami GFP dodatnimi.
W tym reprezentatywnym eksperymencie trzy subpopulacje glejowe można było wyróżnić za pomocą cytometrii przepływowej z pojedynczym przeciwciałem CD 11 B barwiącym CD 11 B, ujemnymi astrocytami GFP ujemnymi i innymi komórkami glejowymi mikrogleju CD11 B dodatnimi komórkami GFP oraz subpopulacją CD 11 B dodatnią GFP. Dwie ostatnie subpopulacje są w stanie internalizować nanocząstki z nieznacznie zwiększonym niedoborem przez populację GFP dodatnią. Internalizację nanocząstek można dodatkowo zweryfikować za pomocą mikroskopii konfokalnej, jak pokazano na tym obrazie, przy użyciu nanocząstek dwutlenku krzemu z pręcikami dominowymi.
Podczas próby tej procedury należy pamiętać, aby trzymać próbki w ciemności, aby uniknąć bielenia barwników fluorescencyjnych i utrzymywać próbki w temperaturze czterech stopni podczas inkubacji przeciwciał. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak mikroskopia konfokalna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytanie dotyczące wewnątrzkomórkowej lokalizacji nanocząstek.
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na oddziaływaniu fluorescencyjnych nanocząsteczek z subpopulacjami pierwotnych komórek układu odpornościowego z wykorzystaniem cytometrii przepływowej. Metoda ta umożliwia ilościowe określenie internalizacji nanocząsteczek w różnych komórkach odpornościowych, dostarczając informacji na temat ich zachowania.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Nanotechnologia
- Cytometria przepływowa
Wstęp
- Nanocząstki mogą być wykorzystywane do badania oddziaływań komórek odpornościowych.
- Cytometria przepływowa oferuje w porównaniu z mikroskopią korzyści w zakresie ilościowego oznaczania fluorescencji.
- Zrozumienie procesu internalizacji nanocząstek może pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych.
- Różne typy komórek odpornościowych mogą wykazywać zróżnicowane odpowiedzi na nanocząstki.
Cel badania
- Analiza oddziaływania nanocząstek z subpopulacjami komórek odpornościowych.
- Ilościowe określenie szybkości internalizacji nanocząstek w różnych typach komórek.
- Pogłębienie zrozumienia odpowiedzi immunologicznej na terapię nanocząstkami.
Zastosowane metody
- Pierwotne komórki odpornościowe poddano działaniu fluorescencyjnych nanocząstek dwutlenku krzemu.
- Komórki znakowano swoistymi przeciwciałami do analizy cytometrycznej.
- Ustawienia kompensacji dostosowano w celu uwzględnienia interferencji nanocząstek.
- Przeprowadzono testy internalizacji w celu oceny wychwytu nanocząstek.
Główne wyniki
- Różne populacje komórek odpornościowych wykazały zróżnicowany stopień internalizacji nanocząsteczek.
- Cytometria przepływowa skutecznie rozróżniła typy komórek na podstawie intensywności fluorescencji.
- Internalizację potwierdzono za pomocą dodatkowych technik mikroskopowych.
- Wyniki wskazały na zależność od dawki w procesie pobierania nanocząsteczek przez monocyty.
Wnioski
- Badanie wykazuje użyteczność cytometrii przepływowej w analizie oddziaływań nanocząsteczek z komórkami odpornościowymi.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia, w jaki sposób nanocząsteczki mogą wpływać na odpowiedzi immunologiczne.
- Dalsze badania mogą zgłębiać zastosowania terapeutyczne nanocząsteczek w immunologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Metoda ta umożliwia ilościową ocenę internalizacji nanocząsteczek w subpopulacjach pierwotnych komórek odpornościowych, co wspiera walidację celu i ograniczanie ryzyka mechanistycznego w rozwoju nanoterapii. Dostarczając danych o pobieraniu nanocząsteczek w zależności od dawki i typu komórek, zwiększa ona pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania i dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac nad interwencjami opartymi na nanocząsteczkach. Podejście to rozwiązuje kluczowy problem na etapie odkrywania: przekształcanie oddziaływań nanocząsteczka-komórka w praktyczne, powtarzalne wskaźniki służące do priorytetyzacji portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określenie stopnia pobierania nanocząstek przez podgrupy komórek odpornościowych, co pozwala wyjaśnić, które populacje komórek wchodzą w interakcję z nanonośnikami.
- Wartość operacyjna: Umożliwia ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki standaryzowanemu i powtarzalnemu pomiarowi internalizacji za pomocą natężenia fluorescencji oraz przesunięć światła rozproszonego bocznie.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację typów komórek o wysokim lub niskim powinowactwie do nanocząstek, co kieruje wyborem celu dla immunomodulujących nanoterapii.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy komórek odpornościowych do dalszego przesiewu poprzez ustalenie bazowych profili oddziaływań nanocząsteczek.
- Wyniki ilościowe: Generuje wskaźniki intensywności fluorescencji i SSC, które umożliwiają standaryzowane, porównywalne odczyty w różnych warunkach i punktach czasowych.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Wspiera skalowalne procesy przesiewowe dzięki spójnym protokołom bramkowania, kompensacji i znakowania przeciwciałami, które można zastosować do różnych formulacji nanocząsteczek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla badań nad chorobami: Możliwość zastosowania w przypadku pierwotnej mikroglei z myszy mutantów, co umożliwia prowadzenie badań nad nanocząsteczkami ukierunkowanymi na OUN w immunologicznych modelach chorobowych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy wyniki cytometrii przepływowej z potwierdzeniem w mikroskopii konfokalnej, co wzmacnia interpretację mechanistyczną na potrzeby walidacji przedklinicznej.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje dotyczące dalszego rozwoju badań poprzez ujawnianie zróżnicowanych szybkości internalizacji, np. w subpopulacjach mikroglei wykazujących ekspresję GFP, w których stwierdzono zmienne pobieranie nanocząsteczek.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od wczesnego przesiewu w celu oceny wiązania z celem molekularnym po przedkliniczną ocenę mechanistyczną, szczególnie w przypadku nanoterapii immunomodulacyjnych, w których kluczowe są profile interakcji komórek odpornościowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez powiązanie ekspozycji na nanocząsteczki z mierzalnymi zmianami ziarnistości i fluorescencji komórek, co pozwala wyjaśnić mechanizmy aktywacji lub modulacji komórek odpornościowych.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanym etapom izolacji, znakowania i kompensacji, które gwarantują powtarzalną kwantyfikację oddziaływań między nanocząsteczkami a komórkami.
- Analityka: Dostarcza ilościowych pomiarów zmiennych zależnych (intensywność fluorescencji, przesunięcia SSC), co umożliwia porównanie internalizacji w różnych typach komórek, stężeniach i punktach czasowych.
- Badania translacyjne: Łączy z walidacją przedkliniczną poprzez ortogonalne potwierdzenie za pomocą mikroskopii konfokalnej, co jest zgodne z mechanistyczną redukcją ryzyka w oparciu o biomarkery.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonuje jako reużywalna metoda dla różnych formatów nanocząsteczek (np. FITC-SiO₂, Rhodamine-SiO₂) i modeli odpornościowych (leukocyty krwi ludzkiej, mikroglej mysi), co ogranicza redundantny rozwój metod.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez dostarczanie ilościowych danych o internalizacji nanocząsteczek z rozdzielczością do pojedynczych komórek, co zwiększa pewność w określaniu celów w strategiach immunomodulacyjnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki zdefiniowanym protokołom kompensacji i panelom przeciwciał, minimalizując zmienność między użytkownikami i ośrodkami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez wczesną identyfikację subpopulacji odpornościowych podatnych na oddziaływanie nanocząsteczek, co zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach rozwoju nanoterapii.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez wskazanie formulacji nanocząsteczek o korzystnych lub niepożądanych profilach interakcji z komórkami odpornościowymi.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w kompensacji cytometrii przepływowej, w szczególności w zakresie niwelowania zakłóceń rozproszenia bocznego indukowanego przez nanocząsteczki podczas korekcji nakładania się widm.
- Zależne od dostępu do cytometrów przepływowych z możliwością detekcji fluorescencji i rozproszenia, a także od paneli przeciwciał do identyfikacji subpopulacji komórek odpornościowych.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji strategii bramkowania (gatingu) i ustawień kompensacji, aby zapewnić spójną interpretację danych między grupami badawczymi (discovery) a grupami przedklinicznymi.
- Wymaga adaptacji przy zastosowaniu w różnych systemach modelowych (np. komórki adherentne vs. nieadherentne, pierwotne komórki ludzkie vs. mysie) w celu zachowania wierności testu.
- Ograniczenie praktyczne: fluorescencja lub właściwości rozproszenia nanocząsteczek mogą zakłócać działanie niektórych fluorochromów, co wymaga starannego zaprojektowania panelu i walidacji kompensacji, zgodnie z opisem w protokole.
