Oczyszczanie powinowactwem kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy z chromatyny zakażonych komórek

Wirusy RNA o ujemnej polarności nici. Genom wirusów grypy jest pakowany w formie wirusowych kompleksów rybonukleoproteinowych, lub VRNP, w których jednoniciowy genom jest otoczony białkiem nukleowym i związany z kompleksem polimerazy składającym się z podjednostek PA, PB1 i PB2. Aby oczyścić nienaruszone kompleksy z zainfekowanych komórek ssaków, komórki HeLa inkubuje się z rekombinowanym wirusem grypy z tagiem strept.

Po wniknięciu wirusa do komórek i syntezie wirusowego RNA w jądrach po infekcji, komórki poddaje się lizie z użyciem detergentu, a następnie frakcjonuje na frakcje cytoplazmatyczną, jądrową i chromatynową, wykorzystując wirowanie oraz protokół frakcjonowania chromatyny oparty na soli. Na koniec białka VRP z tagiem strept są oczyszczane metodą powinowactwa z każdej frakcji. Analiza składu białkowego i RNA oczyszczonych vRNPs za pomocą barwienia srebrem wykazuje, że stosując ten protokół, można wyizolować nawet silnie związane z chromatyną VRP w stanie nienaruszonym. Zatem jedną z głównych zalet naszego protokołu w porównaniu do standardowych metod powinowactwa do oczyszczania kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy jest możliwość oczyszczenia vRNPs z chromatyny zainfekowanych komórek, która jest znanym miejscem syntezy mRNA wirusa grypy.

Zatem nasza metoda może być wykorzystana do odpowiedzi na pytania dotyczące regulacji replikacji i transkrypcji wirusowej, na przykład do ustalenia, które czynniki wirusowe lub komórkowe, a także które modyfikacje potranslacyjne są niezbędne dla syntezy wirusowego mRNA lub syntezy wirusowego RNA genomicznego. Badacze rozpoczynający pracę z tą metodą mogą napotkać pewne trudności, ponieważ frakcjonowanie subnuklearne jest bardzo wrażliwe na warunki biochemiczne i może się znacznie różnić w zależności od linii komórkowej. Rozpocznij ten protokół, wykorzystując komórki A549 zakażone wirusem grypy RWSN PB2-Strep, który posiada znacznik Strep genetycznie połączony z końcem C podjednostki PB2, przy wielokrotności zakażenia (MOI) wynoszącej 3.

Przemyj komórki raz zimnym PBS, następnie dodaj 12 ml zimnego PBS i usuń je z naczynia, używając gumowej skrobaczki. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwiruj je w celu uzyskania osadu.

Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest protokół frakcjonowania komórek. Jądra komórkowe są bardzo wrażliwe na procedury homogenizacji i mieszania, a ich nieprawidłowe przeprowadzenie może łatwo zniszczyć ekstrakt chromatyny. Dlatego bardzo ważne jest przestrzeganie nie tylko technik homogenizacji, ale także ogólnych zasad obchodzenia się z lizatami, które prezentujemy w tym materiale.

Po odwirowaniu, odessaniu nadsączu, PBS oraz roztworu resuspendującego, pellet komórkowy zawiesić w 10 mililitrach zimnego buforu sacharozowego. Do plastikowej pipety seryjnej o pojemności 10 mililitrów przymocować końcówkę do pipety o pojemności 200 mikrolitrów i przepuścić przez nią komórki, aby rozbić skupiska komórkowe. Zawiesinę inkubować na lodzie przez 10 minut.

Okresowo i delikatnie odwracaj probówki z komórkami, aby je resuspenderować. Następnie dodaj non IET P 40 do stężenia końcowego 0,5% i mieszaj w wirówce vortex z wysoką prędkością przez 15 sekund; niezwłocznie odwiruj przez 10 minut przy 3 500 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wirówce naktowej. Po wirowaniu usuń nadosad i przenieś go do stożkowatej probówki o pojemności 15 ml.

Przechowywać nadnadfiltr w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Jest to frakcja cytoplazmatyczna. Osad powinien być mniejszy i bielszy niż pierwotny osad komórkowy, jak pokazano tutaj.

Jeśli protokół zostanie ukończony w późniejszym terminie, należy przechowywać pellet komórkowy w temperaturze 4 °C. W przeciwnym razie należy kontynuować, przemywając pellet w 5 mL zimnego buforu sacharozowego i wirując go w taki sam sposób jak poprzednio. Po zakończeniu wirowania należy odrzucić nadsącz i resuspender pellet zawierający jądra w 1,5 mL zimnego buforu do ekstrakcji plazmy jądrowej.

Przenieś resuspendowany osad do schłodzonego, w pełni szklanego homogenizatora o pojemności czterech mililitrów z dopasowanym tłokiem i homogenizuj jądra za pomocą 20 pociągnięć. Należy unikać tworzenia piany; opór powinien wzrosnąć po około 10 pociągnięciach. Aby potwierdzić efektywność homogenizacji, zbadaj próbkę pod mikroskopem fazokontrastowym.

Jądra nie powinny być już okrągłe, lecz mieć nieregularne kształty i wyglądać tak, jakby pękły. Po homogenizacji jąder przenieś je do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra. Inkubuj homogenat na wirówce rotacyjnej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut.

Następnie odwiruj próbkę w mikrocentryfudze przy 16 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu przenieś supernatant, który stanowi frakcję plazmy jądrowej, do probówki o pojemności 1,5 ml i przechowuj go w temperaturze 4 °C. Następnie ponownie zawieś osad w 1,5 ml buforu trawiennego, uprzednio ogrzanego do 37 °C.

Następnie inkubuj frakcję przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Dalej dodaj 42 µL pięciomolarnego chlorku sodu, aby uzyskać końcowe stężenie chlorku sodu wynoszące 150 mM, a następnie inkubuj przez 20 minut na lodzie. Wirowarkuj przy 16 000 ×g w mikrocentryfużce w temperaturze 4 °C przez 10 minut.

Po wirowaniu oddziel supernatant i przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Jest to frakcja CH one 50. Osad ponownie zawiesić w 1,5 milliliters zimnego buforu z wysoką zawartością soli i inkubować przez 20 minut na lodzie.

Wiruj w mikrowirówce przy 16 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Po wirowaniu usuń nadosad i przechowuj go w temperaturze 4 °C. Jest to frakcja CH 500.

Wyjmij frakcje zabezpieczone podczas protokołu frakcjonowania i umieść je w lodzie. Następnie do frakcji cytoplazmatycznej dodaj 300 µL 5 M NaCl. Potem przenieś 100 µL upakowanych kulek strep T w Sphero na frakcję do probówki stożkowej o pojemności 15 mL.

Dodaj 10 objętości buforu do płukania strep do kulek. Odwróć probówkę, aby wymieszać zawartość, a następnie wiruj przez pięć minut przy 1000 ×g w wirówce stołowej i odlej nadsącz.

Powtórz płukanie buforem dwukrotnie, a następnie resuspenduj osad w równym объеме buforu do płukania streptawydyny, dodając 200 µL zawiesiny kulek strep-actin do każdej frakcji. Rotuj probówki przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C. Następnie odwiruj probówki przez jedną minutę przy 1000 ×g w temperaturze 4 °C i odlej nadsącz.

Następnie do kulek inkubowanych z frakcją cytoplazmatyczną w probówce o pojemności 15 ml należy dodać jeden mililitr buforu do płukania. Po dodaniu buforu do płukania przenieś kulki do probówki o pojemności 1,5 ml. Płucz kulki przez jedną minutę, a następnie wiruj probówki przez jedną minutę przy 1000 ×g w temperaturze 4 °C.

Powtórz dwukrotnie po ostatnim etapie płukania. Usuń wszystkie ślady buforu do płukania za pomocą płaskiej końcówki pipety. Następnie dodaj 100 µL buforu do elucji, delikatnie wymieszaj i umieść probówki na lodzie na 15 minut.

Podczas inkubacji okresowo mieszaj kuleczki, delikatnie stukając w dno probówek. Po upływie 15 minut odwiruj próbki przez jedną minutę przy 1000 ×g w temperaturze 4 °C. Zbierz nadst નad osadem zawierający eluowane strep-tagowane VRP.

Komórki zostały zainfekowane szczepem wirusa grypy WSN przez dziewięć godzin, a frakcjonowane lizaty przeanalizowano metodą western blotting, jak pokazano tutaj. Delikatna izolacja jąder pozwala na efektywne wydzielenie białek cytoplazmatycznych, takich jak tubulina, przy jednoczesnym uniknięciu uwalniania licznych białek jądrowych. Należy zauważyć, że frakcja chromatyny wyekstrahowana w niskim zasoleniu jest wzbogacona w białka istotne dla transkrypcji.

Podczas gdy frakcja o wysokim zasoleniu zawiera głównie nukleosomy, w celu określenia składu białkowego eluowanej frakcji cytoplazmatycznej przeanalizowano vRNP z komórek R zainfekowanych przez dziewięć godzin wirusem nieoznaczonym, RWSN lub RWSN PB2-strep, stosując barwienie srebrem, jak pokazano dla eluatu cytoplazmatycznego. Widoczny jest tutaj wysoki stosunek NP do PA, PB1 i PB2, o czym świadczy główny prążek powyżej 55 kilodaltonów w porównaniu do prążków między 95 a 100 kilodaltonów, co sugeruje, że większość białka strep PB2 jest oczyszczana jako część w pełni uformowanego vRNP, innymi słowy, wychwycono niewielką ilość rozpuszczalnej polimerazy w celu porównania względnych wydajności. vRNP oczyszczone po dziewięciu godzinach infekcji szczepami RWSN PB2-strep lub RWSN poddano barwieniu srebrem, jak pokazano na tym żelu z barwieniem srebrem; vRNP mogą być oczyszczone ze wszystkich czterech frakcji komórkowych po dziewięciu godzinach infekcji.

Najwyższe stężenie vRMP znajduje się w plazmie jądrowej, choć znaczne ilości można również oczyścić z cytoplazmy i chromatyny. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak oczyścić wysokie wydajności nienaruszonych kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy z jąder zainfekowanych komórek. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o stosowaniu czystych buforów i unikaniu niepotrzebnego wystawiania próbek na temperaturę pokojową, co pozwoli zapobiec degradacji zarówno RNA, jak i białek, a także uniknąć rozpadu kompleksów białkowych.

Należy pamiętać, że praca z zakaźnym wirusem grypy może być niebezpieczna. Wszystkie etapy powinny być przeprowadzane na stanowisku pracy o drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2) aż do momentu dodania NP 40 do lizatów.