Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej oraz ich zastosowanie w badaniu transmigracji neutrofili w warunkach przepływu

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie wysokiej jakości ludzkich komórek śródbłonka i wykorzystanie ich do zbadania mechanizmów regulujących transmigrację neutrofili w warunkach przepływu przeciwprądowego. Jest to realizowane poprzez początkowe wyizolowanie i wysianie ludzkich komórek śródbłonka pępowiny. Drugim krokiem jest przeniesienie komórek do komór IBD.

Następnie świeżo wyizolowane ludzkie neutrofile są naniesione na aktywowane komórki śródbłonka, co prowadzi do toczenia się neutrofili, ich silnej adhezji oraz transmigracji. Ostatnim krokiem jest ilościowe określenie transmigracji za pomocą mikroskopii wideo. W końcowej fazie można wykorzystać mikroskopię fluorescencyjną i w świetle przechodzącym do oceny transmigracji neutrofili przez aktywowane komórki śródbłonka.

Izolacja komórek śródbłonka jest łatwa do opisania, ale trudna do opanowania, częściowo dlatego, że kluczowe etapy wymagają wizualizacji pępowiny. Z tego powodu wizualna demonstracja tej metody jest krytyczna. Metoda ta pomoże nam zrozumieć kluczowe kwestie w dziedzinie stanu zapalnego, takie jak przebieg rekrutacji leukocytów w warunkach przepływu, a także pozwoli lepiej zrozumieć zachowanie komórek śródbłonka w warunkach przepływu.

Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat rekrutacji neutrofili podczas stanu zapalnego, można ją również zastosować do rzadkich populacji leukocytów, takich jak komórki NK oraz eozynofile. Procedurę tę, wraz z Ritu Sharmą, prezentuje Hong Jang, technik w moim laboratorium. Przynajmniej na godzinę przed procedurą należy przygotować i inkubować kolbę T 75 z żelatyną w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie rozpocznij procedurę izolacji komórek śródbłonka w komorze z laminarnym przepływem powietrza, używając nożyczek do odcięcia pępowiny z łożyska. Po założeniu sterylnych rękawiczek dokładnie obejrzyj pępowinę i odrzuć wszelkie fragmenty zawierające skrzepy krwi lub uszkodzone w wyniku zaciskania pępowiny podczas porodu. Następnie zidentyfikuj dwie tętnice i jedną żyłę znajdujące się w pępowinie.

Następnie ostrożnie wprowadź kaniulę z przymocowanym do niej dwudrożnym kurkiem do jednego z końców żyły, a następnie załóż zacisk na kaniulę, aby mocno utrzymać ją w pozycji. Jednym z najtrudniejszych etapów procedury jest perfuzja pępowiny. Aby zapewnić powodzenie tej czynności, perfunduj pępowinę nadmiarem buforu i obserwuj przepływ, aż płyn stanie się przejrzysty.

Przepłucz żyłę buforem do pępowiny, aż wypływ stanie się przejrzysty, a następnie zaklemuj koniec pępowiny. Podczas perfuzji zdarza się, że ujawnia się niewielki otwór powstały w wyniku pobrania krwi pępowinowej przez lekarzy. W takich sytuacjach można użyć kleszczyków hemostatycznych do zablokowania otworu, co pozwoli na kontynuowanie perfuzji w celu wyizolowania komórek śródbłonka.

Kluczowe znaczenie ma precyzyjne określenie czasu obróbki kolagenazą. Zbyt krótki czas spowoduje niedostateczną liczbę zebranych komórek śródbłonka, natomiast zbyt długi może doprowadzić do zanieczyszczenia preparatu komórkami mięśni gładkich lub uszkodzenia komórek śródbłonka. Następnie należy przepłukać żyłę świeżo przygotowaną, ciepłą kolagenazą.

Zamknąć kurek i inkubować pępowinę w zlewce zawierającej ciepły bufor do pępowiny. Po 10 minutach wyjąć i delikatnie masować pępowinę, aby odizolować komórki śródbłonka z światła żyły. Zlać roztwór do probówki zawierającej pięć mililitrów pożywki dla komórek śródbłonka lub ECM, płucząc pępowinę dwa razy buforem do pępowiny w celu usunięcia pozostałych komórek.

Następnie wirować komórki przez 10 minut przy 50 ×g. W temperaturze pokojowej usunąć nadsącz, a następnie resuspendować osad. Komórki przenieść do kolby T 75 powlekanej żelatyną w 10 ml pożywki dla komórek śródbłonka i hodować komórki śródbłonka przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Następnego dnia delikatnie potrząsnąć kolbą, aby usunąć pozostałe erytrocyty.

Następnie należy usunąć supernatant i wypłukać hodowlę komórek śródbłonka ciepłym HBSS. Po usunięciu HBSS komórki należy zasilić 10 mililitrami ciepłego ECM. Następnie należy zbadać komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że erytrocyty zostały usunięte, oraz ocenić stopień konfluencji i morfologię komórek śródbłonka.

Należy kontynuować wymianę pożywki co trzy dni, aż komórki osiągną pełną konfluencję. W tym momencie należy przeprowadzić pasaż komórek, używając roztworu trypsyny i EDTA. Następnie odseparowane komórki należy zebrać i resuspendować w ECM.

Na koniec pokryj żelatyną każdą studnię komory IBD. Usuń nadmiar żelatyny, a następnie do każdej studni komory dodaj 1,5 × 10⁶ na mililitr zawiesiny komórek śródbłonka. Rozpocznij od indukowania nadekspresji cząsteczek adhezyjnych i aktywacyjnych na powierzchni komórek poprzez inkubację komórek śródbłonka z odpowiednim stymulatorem w celu ich aktywacji.

Wyizoluj neutrofile z krwi obwodowej zdrowych ochotników poprzez centryfugację gradientową zgodnie z wcześniej opublikowaną metodą, a następnie zawieś komórki w stężeniu 1 × 10⁶ na ml w HBSS z dodatkiem albuminy ludzkiej. Po przygotowaniu mikroskopu podłącz komorę IBD zawierającą stymulowane komórki śródbłonka do przewodów mikroskopu. Wybierz obiektyw do kontrastu fazowego 10x, a następnie ustaw pompę strzykawkową na pobieranie i rozpocznij przepływ HBSS przy żądanym naprężeniu ścinającym.

Krótkotrwale zatrzymaj przepływ, przekręcając trójdrożny kurek odcinający po stronie wylotowej do pozycji zamkniętej i przełączając linię wlotową z HBSS na izolowane neutrofile. Wznów przepływ, przekręcając kurek z powrotem do pozycji otwartej. Następnie rozpocznij rejestrację obrazu za pomocą kamery CCD podłączonej do rejestratora DVD.

Uruchom stoper. Gdy po czterech minutach neutrofile wpłyną do komory, przełącz z powrotem na HBSS, aby zapobiec przywieraniu nowych neutrofili. Jeśli wymagane są dane dotyczące całkowitej liczby interakcji, toczenia oraz silnej adhezji, należy użyć obiektywu 10x w kontraście fazowym.

Należy obrazować sześć losowych pól przez 10 sekund każde w przedziale między czwartą a piątą minutą. Następnie należy przełączyć na obiektyw 40 x i zarejestrować pojedyncze pole widzenia w interesującym czasie. Po perfuzji neutrofili w 10. minucie należy zebrać od pięciu do 10 losowych pól widzenia.

Niestymulowane komórki śródbłonka nie wspierają rekrutacji neutrofilów. Dlatego na poniższych rycinach przedstawiono neutrofile wchodzące w interakcję ze stymulowanymi TNF alpha komórkami śródbłonka. Zwróć uwagę na neutrofil adherentny, wskazany żółtą grotą strzałki, oraz neutrofil w trakcie transmigracji, oznaczony białą grotą strzałki.

Transmigracja neutrofili może zachodzić w szczelinach międzykomórkowych lub bezpośrednio przez komórki śródbłonka. Aby rozróżnić te dwa stany, komórki śródbłonka oznakowano przeciwciałem anty-VE coherent. Jak widać tutaj na czerwono, transmigrację ocenia się jako parakomórkową lub transkomórkową.

W tym modelu niemal cała transmigracja ma charakter parakomórkowy, co obrazuje ta rycina przedstawiająca nałożenie dwóch poprzednich rysunków. Na pierwszym z trzech wykresów przeanalizowano i zmierzono interakcje neutrofili z wykorzystaniem oprogramowania Image J. Należy zauważyć, że znacznie więcej interakcji neutrofili z komórkami śródbłonka wystąpiło pomiędzy neutrofilami a komórkami śródbłonka aktywowanymi TNF alpha niż w przypadku kontrolnych, niepobudzonych komórek śródbłonka.

Całkowitą liczbę oddziałujących komórek dalej charakteryzowano jako toczące się, silnie przylegające lub migrujące przez śródbłonek, analogicznie do poprzednich etapów. Znacząco większa transmigracja neutrofili wystąpiła w studniach zawierających aktywowane komórki śródbłonka po ich izolacji. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania związane z biologią komórek śródbłonka po ich rozwoju można zastosować inne metody, takie jak western blotting, PCR w czasie rzeczywistym oraz pomiar oporu śródbłonka.

Niniejsza metoda pomoże badaczom z zakresu stanu zapalnego i biologii naczyniowej zrozumieć, w jaki sposób zachodzi rekrutacja leukocytów w warunkach przepływu w ludzkim systemie modelowym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak izolować ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej i wykorzystywać je do badania transmigracji neutrofili w warunkach przepływu przy użyciu komory ity.