Mutageneza z użyciem pirosiarczynu w pojedynczych oocytach

Ogólnym celem tej procedury jest analiza metylacji DNA w pojedynczym oocycie. Osiąga się to poprzez uprzednie usunięcie komórek cumulus oraz soap palita z pobranych oocytów. Drugim krokiem jest osadzenie oocytu w roztworze lizującym aros w stosunku dwa do jednego, aby chronić niewielką ilość DNA przed utratą lub degradacją.

Następnie przeprowadzana jest mutogeneza z użyciem pirosiarczynu, po której następuje amplifikacja za pomocą zagnieżdżonej reakcji łańcuchowej polimerazy. Ostatnim etapem jest ligacja i klonowanie produktu PCR. Następnie wyselekcjonowane klony są amplifikowane metodą PCR i przekazane do sekwencjonowania.

Ostatecznie, mutageneza z użyciem pirosiarczynu i sekwencjonowanie są wykorzystywane do wykazania metylacji DNA w obrębie cytozyny-fosforanu-guaniny, czyli dinukleotydów CpG w regionie zainteresowania w pojedynczym oocycie. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mutageneza z użyciem pirosiarczynu w dużych populacjach komórek, jest możliwość uzyskania danych z pojedynczego oocytu bez konieczności łączenia komórek, co eliminuje błąd PCR oraz kontaminację komórkami somatycznymi. W dniu pobierania oocytów należy na świeżo przygotować roztwory wymienione w protokole pisemnym; podczas przygotowywania roztworów należy zmniejszyć ryzyko kontaminacji DNA poprzez częstą zmianę rękawiczek i stosowanie końcówek z filtrem, a także utrzymywać otwarte probówki pod kątem i zakręcać je wszystkie, gdy nie są używane.

Rozpocznij pobieranie oocytów poprzez umieszczenie wypreparowanych jajowodów myszy w pożywce M2 i użycie pęsety M do wyodrębnienia kompleksów cumulus-oocyt. Następnie oddziel oocyty od kompleksów cumulus, wykorzystując roztwór hialuronidazy o stężeniu 0,3 mg/mL w kropli 30 µL pożywki M2. Pozostaw oocyty w roztworze tylko na czas niezbędny do usunięcia komórek cumulus, ponieważ długotrwała ekspozycja może im zaszkodzić.

Przemyj oocyty w kroplach 30 µL pożywki M two, przenosząc oocyty z kropli do kropli. Okresowo usuwaj komórki cumulus podczas łącznie trzech przemyć. Usuń Z z LUCITA, używając kwaśnego roztworu tyrozyny.

Najpierw umieść oocyty w jednej kropli 30 µl roztworu, a następnie przenieś je do kolejnej kropli 30 µl. Zapobiegnie to rozcieńczeniu kwasu przez przeniesione medium, co mogłoby obniżyć jego wydajność. Pozostaw komórki w roztworze tylko na czas niezbędny do usunięcia strefy błonowej, ponieważ długotrwała ekspozycja może doprowadzić do ich uszkodzenia.

Po usunięciu błony przejrzystej ponownie przemyj oocyty w 30 µL kropli medium M2. Aby przeprowadzić zatapianie w agarozie, w pierwszej kolejności umieść roztwór lizujący na bloku grzewczym ustawionym na 70 °C. Dodaj podgrzaną agarozę o niskiej temperaturze topnienia (LMP) do roztworu lizującego, zachowując stosunek agarozy do roztworu lizującego 2:1. Następnie umieść pojedynczy oocyt na czystym szkiełku przedmiotowym w minimalnej ilości medium M2.

Kolejnym krokiem jest osadzenie pojedynczej komórki w roztworze Agros i lizy. Należy wykonać to szybko, ponieważ Agros twardnieje w temperaturach poniżej 65 °C. Pod mikroskopem pobierz 10 µL roztworu Agros do lizy za pomocą końcówki pipety.

Delikatnie nanieś około 1 µL lub mniej roztworu lizującego agros na szkiełko przedmiotowe, pozwalając mu zmieszać się z minimalnym medium. Ostrożnie pobierz oocyt do końcówki pipety. Następnie przenieś całe 10 µL do probówki typu einor zawierającej 300 µL oleju mineralnego, tak aby powstała kropla przybrała kształt sferyczny.

Inkubuj probówkę na lodzie przez 10 minut w celu przeprowadzenia lizy. Usuń 300 µL oleju mineralnego i dodaj 500 µL buforu do lizy SDS. Inkubuj próbkę przez noc w kąpieli wodnej ustawionej na 50 °C w drugim dniu.

Przygotuj świeże roztwory do mutogenezy siarczkiem bismutu zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Rozpocznij mutogenezę od całkowitego usunięcia 500 µL buforu do lizy SDS. Należy pamiętać, że jakikolwiek pozostały bufor do lizy rozcieńczy agros podczas podgrzewania, a kuleczki będą bardziej podatne na rozpuszczenie w kolejnych etapach.

Po całkowitym usunięciu buforu lizującego należy dodać 300 µL oleju mineralnego. Próbkę inkubuje się przez dwie i pół minuty w bloku grzewczym ustawionym na 90 °C. Należy zachować ostrożność, aby nie mieszać, nie wstrząsać ani nie powodować wahań temperatury.

Po dwóch i pół minutach inkubować próbkę na lodzie przez 10 minut. Aby przeprowadzić denaturację, usunąć olej mineralny i dodać do probówki 1 ml 0,1 M wodorotlenku sodu, a następnie lekko uderzyć w probówkę i odwrócić ją pięć do sześciu razy.

Inkubować próbkę przez 15 minut. W kąpieli wodnej ustawionej na 37 °C, odwracając probówkę co trzy do czterech minut, kuleczka powinna unosić się w wodorotlenku sodu. Należy zwrócić uwagę, że kuleczka nie znajduje się już na dnie probówki.

Aby przeprowadzić obróbkę siarczynową, najpierw delikatnie odwiruj probówkę po usunięciu wodorotlenku sodu. Dodaj 300 µL oleju mineralnego oraz 500 µL roztworu siarczynu BIS. Należy unikać ekspozycji na światło i inkubować probówkę przez trzy i pół godziny w kąpieli wodnej o temperaturze 50 °C.

Następnie przeprowadź denaturację. Najpierw inkubuj próbkę na lodzie przez trzy minuty, a następnie usuń olej mineralny i roztwór siarczynu BIS. Po delikatnym wirowaniu dodaj 1 ml 0,3 M wodorotlenku sodu, a następnie delikatnie uderz w dno probówki i odwróć ją pięć do sześciu razy.

Inkubować próbkę przez 15 minut w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, odwracając probówki co trzy do czterech minut; ponownie przypominamy, że przed rozpoczęciem reakcji PCR kuleczki powinny unosić się w wodorotlenku sodu. Przemyć próbki, rozpoczynając od delikatnego wirowania.

Następnie usunąć wodorotlenek sodu i dodać 1 ml 1x TE pH 7,5. Wstrząsać przez 5 do 10 minut w temperaturze pokojowej. Po drugim delikatnym wirowaniu usunąć 1x TE.

Powtórz ten proces płukania dwukrotnie. Następnie dodaj 1 mL autoklawowanej wody dwukrotnie destylowanej. Mieszaj przez 5 do 10 minut w temperaturze pokojowej, odwiruj delikatnie po raz trzeci i usuń wodę.

Powtórzyć płukanie wodą podwójnie destylowaną dwukrotnie. Na koniec usunąć cały nadsącz, pozostawiając jedynie kuleczki aros. Sprawdzić, czy pH nadsączu wynosi 5.0.

Jeśli nadsącz jest nadal zbyt zasadowy, należy ponownie przemyć kuleczki wodą dwukrotnie destylowaną. W międzyczasie do probówki PCR należy dodać mieszaninę do pierwszej rundy PCR zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Przesuń solid agro speed do krawędzi probówki einor.

Następnie ostrożnie przenieś agro speed do probówki PCR, podgrzej do 70 °C przez jedną minutę i wymieszaj, a następnie przeprowadź amplifikację zgodnie z zaleceniami w protokole pisemnym. Po pierwszej rundzie amplifikacji przygotuj reakcję PCR dla drugiej rundy, używając 5 µL produktu z pierwszej rundy jako matrycy. Należy upewnić się, że pipetowanie odbywa się poniżej warstwy oleju mineralnego.

Należy przeprowadzić drugą rundę amplifikacji zgodnie z instrukcją w tekście w ramach testu diagnostycznego. Próbki z drugiej rundy można poddać trawieniu enzymem restrykcyjnym specyficznym dla metylacji lub szczepu, a następnie przeprowadzić elektroforezę produktów trawienia na żelu z 8% akryloamidu. Wszelkie powstałe heterogeniczne prążki reprezentują więcej niż jedną sekwencję. Aby sklonować produkt drugiej rundy, należy go ligować z wektorem i przeprowadzić klonowanie TA, zgodnie z opisem w manuskrypcie towarzyszącym temu filmowi. Po klonowaniu TA całą mieszaninę reakcyjną należy wysiać na płytkę z agarem LB z dodatkiem ampicyliny, X-gal i IPTG, a następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez noc.

Następnie do probówki PCR należy dodać mieszaninę reakcyjną (master mix) do kolonialnej PCR, zgodnie z listą w protokole pisemnym. Za pomocą końcówki pipety należy pobrać białą kolonię bakterii z płytki i zawiesić ją w 35 µL mieszaniny reakcyjnej do kolonialnej PCR w probówce PCR. Następnie należy przeprowadzić amplifikację zawiesiny zgodnie z opisem w tekście; po amplifikacji PCR należy nanieść 4 µL produktu PCR na żel AGROS 1,5% w celu przeprowadzenia elektroforezy.

Na koniec należy przesłać około 30 µL produktu PCR w celu sekwencjonowania pięciu reakcji colony PCR na cyte. Po uzyskaniu wyników sekwencjonowania można odczytać wzory metylacji; każda oryginalna cytozyna-guanina, która pozostała w niezmienionej formie, była zmetylowana. I odwrotnie, każda oryginalna cytozyna-guanina, która obecnie jest tyminą-guaniną, była niezmetylowana po amplifikacji nested PCR z użyciem starterów konwertowanych siarczynem.

Możliwe jest potwierdzenie pomyślnej konwersji poprzez wizualizację fragmentu o prawidłowej wielkości w pojedynczej metafazie na żelu agarozowym. Dwa oocyty reprezentują jeden allel rodzicielski i teoretycznie posiadają jeden wzór metylacji imprintingowej. W ten sposób produkty drugiej rundy PCR mogą zostać przetestowane pod kątem niezamierzonej kontaminacji.

Enzym restrykcyjny wrażliwy na metylację DNA może zostać wykorzystany do trawienia produktu drugiej rundy PCR w celu oceny, czy zawiera on allel zmetylowany czy niezmetylowany. W tym przypadku rozcinana jest zmetylowana cytozyna w obrębie sekwencji rozpoznawanej przez enzym. Z kolei niezmetylowana cytozyna, która została przekształcona w tyminę, nie jest już rozpoznawana przez enzym i pozostaje nierozcięta; każda próbka oocytu w metafazie II zawierająca zarówno allele zmetylowane, jak i niezmetylowane, powinna zostać odrzucona, ponieważ świadczy to o kontaminacji komórkami cumulus lub obecności ciałka polarnego po ligacji i transformacji.

Pomyślną amplifikację kolonii metodą PCR można zwizualizować na żelu AROS, aby upewnić się, że do sekwencjonowania zostaną wysłane próbki o prawidłowej wielkości produktu. W tym przykładzie oczekiwana wielkość amplikonu po ligacji wynosi 56 par zasad. W tym przypadku klon pięć ma nieprawidłową wielkość amplikonu i nie powinien zostać wysłany do sekwencjonowania.

Sekwencjonowanie pięciu pojedynczych klonów z oocytu w metafazie II powinno wykazać pięć identycznych wzorów metylacji oraz identyczne wskaźniki konwersji poza miejscami CpG. Wszelkie próbki zawierające więcej niż jeden wzór należy odrzucić. Ponieważ owulowane oocyty w metafazie II posiadają dwie kopie chromosomów lub przytwierdzone ciałko polarne, istnieje możliwość uzyskania dwóch podobnych wzorów sekwencji.

Należy odrzucić dane z wszystkich komórek wykazujących wysoce odmienne wzorce metylacji. Ponieważ podczas wykonywania tej procedury nie można wykluczyć zanieczyszczenia komórkami cumulus, ważne jest, aby po pierwsze kilkukrotnie przemyć oocyty w świeżym medium po obróbce HI IDE, w celu usunięcia jak największej liczby komórek cumulus. Po drugie, agar o niskiej temperaturze topnienia twardnieje w temperaturach poniżej 65 °C, dlatego należy pracować ostrożnie, lecz szybko.

Na koniec należy pamiętać, że wodorosiarczan sodu oraz hydrochinon są światłoczułe, dlatego probówki z reakcją oraz roztwory powinny zostać owinięte folią.