Optyczna rejestracja ponadprogowej aktywności neuronalnej z rozdzielczością pojedynczych komórek i pojedynczych impulsów

Ogólnym celem eksperymentu FollowMe jest rejestracja aktywności impulsowej dużych populacji neuronów. W pierwszym etapie osiąga się to poprzez obserwację wzrostu wewnątrzkomórkowego stężenia jonów wapnia w somie neuronu, powiązanego z każdym potencjałem czynnościowym, z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej. Do rejestracji sygnałów fluorescencji wapnia z 40 som neuronów z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową zastosowano dwufotonowe wzbudzenie oraz zasadę skanowania z dostępem swobodnym.

W drugim kroku precyzyjne momenty wystąpienia impulsów (spike timings) są wyodrębniane z sygnałów fluorescencyjnych przy użyciu algorytmu dekonwolucji. Technika ta może być wykorzystywana do rejestrowania aktywności impulsowej dziesiątek neuronów. Uzyskane dane o impulsach mogą następnie służyć do pomiaru informacji wzajemnej, propagacji sygnału między populacjami neuronów lub korelacji neuronowych.

Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak rejestracje mikroelektrodowe, jest możliwość zapisu aktywności impulsacyjnej dużej liczby neuronów z lokalnej populacji. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące funkcji kory na poziomie lokalnych sieci neuronowych, takie jak znaczenie korelacji w poszukiwaniu informacji oraz zmiany w dynamice sieci związane z plastycznością kory. Do wzbudzenia dwufotonowego wykorzystuje się system laserowy impulsowy w podczerwieni z impulsami femtosekundowymi. Wymagana jest wysoka moc wyjściowa lasera, aby zrekompensować duże straty wprowadzane przez komponenty optyczne układu.

Układ prekompensacyjny składający się z dwóch pryzmatów nadaje impulsom laserowym ujemną dyspersję prędkości grupowej przed ich wejściem do optycznych deflektorów, aby zrekompensować dyspersję czasową wprowadzaną przez AOD. Dwa AOD z dużymi aperturami odchylają wiązkę laserową w dwóch wymiarach. Refleksyjna siatka dyfrakcyjna o gęstości 100 kresek na milimetr jest umieszczona 13 centymetrów za AOD w celu kompensacji dyspersji przestrzennej wprowadzanej przez AOD. W przypadku użycia krótkich impulsów laserowych, wiązka laserowa jest kierowana za pomocą dwóch teleskopów przekaźnikowych do portu kamery mikroskopu prostego.

Przysłony są rozmieszczone w regularnych odstępach w celu wyrównania komponentów optycznych. Dichroiczny dzielnik wiązki umieszczony przed obiektywem transmituje podczerwone światło wzbudzenia do preparatu i odbija światło fluorescencyjne z preparatu na detektor. Detektory fluorescencji epi- i trans- zbierają sygnał fluorescencyjny poprzez obiektyw, a przed detektorami umieszczone są kolorowe filtry szklane kondensatora, aby zapobiec przedostawaniu się światła wzbudzenia do detektorów.

Kąty odchylenia A OD są kontrolowane przez komputer wyposażony w płytkę przetwornika cyfrowo-analogowego, która z kolei steruje oscylatorami sterowanymi napięciowo. Sygnał z fotopowielaczy jest przekazywany przez filtr dolnoprzepustowy Butterwortha o częstotliwości odcięcia 100 kHz i digitalizowany przez przetwornik analogowo-cyfrowy z częstotliwością taktowania 156,25 kHz przed zapisaniem w komputerze do analizy; dopasowanie i szum elektryczny są testowane poprzez rejestrację rozkładu sygnałów fluorescencyjnych z i bez światła laserowego przy niskim i wysokim wzmocnieniu fotopowielaczy, a także z i bez ditherowania wskaźnika. Skanowanie z losowym dostępem opiera się na detekcji wewnątrzkomórkowych wzrostów poziomu wapnia. Pierwszym krokiem protokołu jest zabarwienie dużej liczby neuronów estrową formą wskaźnika wapnia poprzez iniekcję bolusową.

Następnie zarejestruj aktywność somy każdego neuronu w czterech lokalizacjach przez 6,4 microseconds w każdej z nich. Aby wybrać interesujące neurony, wykonaj pełny obraz składający się z 256 na 256 pikseli. Następnie ręcznie zaznacz w tym obrazie środki neuronów, których aktywność ma zostać zarejestrowana.

Oprogramowanie sterujące w każdym cyklu automatycznie dodaje trzy punkty w odległości 2 µm wokół każdego centrum. Sygnał fluorescencyjny jest rejestrowany z czterech lokalizacji we wszystkich 40 neuronach. Rejestracja ze wszystkich neuronów w jednym cyklu trwa 1,536 ms.

Powtórz tę sekwencyjną rejestrację wszystkich 40 neuronów przez pięć sekund. Wykrywanie impulsów z fluorescencyjnych sygnałów wapniowych w somie opiera się na wysokim stosunku sygnału do szumu. Wysoki stosunek sygnału do szumu można osiągnąć poprzez zwiększenie intensywności wzbudzenia.

Natyżenie wzbudzenia można jednak zwiększyć tylko do pewnej granicy ze względu na fotouszkodzenia. Istnieje jedynie bardzo wąski zakres natężenia wzbudzenia, w którym fotouszkodzenia są niskie, a stosunek sygnału do szumu jest wystarczający do wykrywania pojedynczych kolców, co pozwala zapewnić, że rejestrowane sygnały mieszczą się w oknie wysokiej detekcji kolców. Podczas eksperymentu wykorzystuje się szereg programów do analizy online opracowanych w naszym laboratorium.

Następnie oblicz przybliżoną liczbę fotonów na neuron w krótkim oknie czasowym szumu bazowego wynoszącym około 100 do 200 milisekund. Liczbę fotonów oraz tempo emisji fotonów oblicza się z wartości fluorescencji poprzez dopasowanie rozkładu względnych zmian fluorescencji do tego równania, a następnie oblicza się fluorescencję bazową z tego samego okna czasowego i przedstawia ją w funkcji czasu lub prób. Utrzymuj średni spadek poziomu bazowego poniżej 0,0002 na sekundę poprzez regulację mocy lasera.

Ponieważ wykrywanie impulsów gwałtownie spada po przekroczeniu tego limitu. Następnie co 10 do 20 minut weryfikuj pozycje somatyczne neuronów, wykonując obraz pełnej klatki. W razie potrzeby skoryguj miejsca rejestracji.

Sygnały fluorescencyjne wynikające z aktywności neuronalnej często są opóźnione w czasie ze względu na długi czas zaniku przejściowego stężenia wapnia. W niniejszej procedurze zastosowano metodę dekonwolucji w celu wyznaczenia impulsów oraz czasu ich wystąpienia na podstawie sygnałów fluorescencyjnych. Wykorzystujemy tutaj algorytm genetyczny, aby określić najbardziej prawdopodobny model pociągu impulsów pasujący do zarejestrowanego sygnału fluorescencyjnego.

Z każdą iteracją algorytmu maksymalna wiarygodność asymptotycznie dąży do swojego maksimum, które jest determinowane przez szum zapisów fluorescencji. W niejednorodnych populacjach neuronów sygnał wapniowy wywołany impulsem może różnić się między neuronami. W celu nienadzorowanej analizy dużych zbiorów danych opracowaliśmy algorytm, który uwzględnia zmienność sygnału wapniowego wywołanego impulsem z neuronu na neuron, aby uniknąć dużej liczby wyników fałszywie dodatnich.

Wspólny rozkład amplitudy i stałej czasu zaniku przejściowych sygnałów wapniowych wywołanych pojedynczym kolcem zarejestrowano w oddzielnym zestawie eksperymentów na tym samym typie neuronów w tych samych warunkach doświadczalnych. Aby uwzględnić powolne zmiany linii bazowej i zmniejszyć koszty obliczeniowe dekonwolucji, dłuższe pomiary podzielono na kilka krótszych śladów o długości od jednej do pięciu sekund dla każdego neuronu w każdym pomiarze. Algorytm dekonwolucji może testować dużą liczbę modeli, nawet do 1 miliona różnych modeli lub więcej; aby przyspieszyć dekonwolucję, jeden eksperyment jest dekonwolwowany równolegle na maksymalnie 10 różnych komputerach.

Po dekonwolucji dane o impulsach są analizowane i sprawdzane. Histogram prawdopodobieństwa wystąpienia impulsu w czasie wokół bodźca (PSTH) oraz częstotliwość wyładowań neuronu są obliczane w sposób zautomatyzowany. Poniżej przedstawiono przykłady sygnału fluorescencyjnego zarejestrowanego przy bardzo niskiej częstotliwości pobudzenia oraz innego przy bardzo wysokiej częstotliwości pobudzenia w oknie detekcji.

Należy zauważyć, że każdy przykład przedstawia odpowiedź na jeden impuls. Przedstawiona tutaj fotomikrografia obrazuje ostry skrawek mózgu oraz dwie pipety stymulacyjne umieszczone w tej samej kolumnie korowej. W warstwie czwartej widoczne są odpowiedzi neuronalne na powtarzalne bodźce, a ten wykres przedstawia wzajemną informację Shannona sygnalizowaną przez zarejestrowaną populację neuronów.

Poniżej przedstawiono pomiar propagacji aktywności impulsowej powyżej progu między różnymi populacjami neuronów kory mózgowej. Są to wykryte impulsy w neuronach korowych będące odpowiedzią na stymulację elektryczną włókien wzgórzowo-korowych. Podczas rejestracji aktywności neuronalnej przy użyciu skanowania z dostępem swobodnym bardzo ważne jest, aby rejestracja odbywała się w obrębie okna detekcji.

W przeciwnym razie bardzo łatwo jest otrzymać nieużyteczne zestawy danych. Detekcja impulsów optycznych jest wciąż w fazie początkowej. Istnieje wiele możliwości ulepszenia tej metody.

Dzięki wprowadzeniu pewnych ulepszeń rejestrujemy sygnały z jeszcze większej liczby neuronów. Wprowadzenie innych udoskonaleń pozwoli nam na prowadzenie pomiarów nawet u zwierząt budzących się i wykazujących aktywność behawioralną.