Pomiar uwalniania dopaminy z pojedynczej komórki przy jednoczesnym zastosowaniu zacisku napięciowego i amperometrii
21 listopada 2012
Technika amperometryczna mierzy uwalnianie dopaminy z pojedynczej komórki poprzez wykrywanie prądu utleniania powstającego podczas spontanicznego utleniania dopaminy. Metodologia jednoczesnego zaciskania napięcia (voltage clamp) i amperometrii ujawnia mechanistyczną zależność między całkowitą „aktywnością” transportera dopaminy a regulacyjną rolą tej aktywności w transporcie zwrotnym dopaminy.
Celem niniejszej procedury jest pomiar transportu zwrotnego dopaminy w neuronie poddanym zaciskaniu potencjału (voltage clamp), przy jednoczesnym zastosowaniu techniki patch clamp i pyrometrii w celu pomiaru uwalniania dopaminy za pośrednictwem białka DAT. Proces ten rozpoczyna się od sprawdzenia sprawności elektrody pyrometrycznej za pomocą dopaminy. W drugim kroku elektrodę pyrometryczną umieszcza się w pobliżu komórki, a następnie za pomocą pipety patch clamp uzyskuje się konfigurację whole cell neuronu.
Następnie, za pomocą pipety do patch-clampu kontrolowane jest napięcie komórki, a jednocześnie przy użyciu elektrody pyrometrycznej rejestrowane jest uwalnianie dopaminy pośredniczone przez DAT. Ostatnim krokiem jest dodanie blokera DAT i ponowne zarejestrowanie prądów z całej komórki oraz prądów pyrometrycznych, co pozwala na odjęcie prądu specyficznie pośredniczonego przez transporter dopaminy. Znaczenie tej techniki polega na możliwości pomiaru transportu zwrotnego dopaminy poprzez transporter dopaminy przy jednoczesnej kontroli napięcia neuronu dopaminergicznego.
System do jednoczesnej rejestracji metodą patch-clamp i barometrii wymaga mikroskopu odwróconego z doskonałą optyką DIC oraz obiektywem o dużej odległości roboczej w celu wytworzenia źródła światła DC dla systemu. Aby zminimalizować szumy elektryczne, oświetlenie mikroskopu należy podłączyć do akumulatora samochodowego. Zastosowano hydrauliczne mikromanipulatory, ponieważ w naszej konfiguracji nie wpływają one w znacznym stopniu na poziom szumów.
Do rejestracji w konfiguracji voltage clamp i whole cell wykorzystuje się manipulator praworęczny, natomiast do pyrometrii manipulator leworęczny. Aby przygotować elektrodę do rejestracji whole cell, należy wyciągnąć pipetę kwarcową za pomocą wyciągacza P 2000. Zazwyczaj stosujemy pipety o oporności od trzech do czterech mega omów.
Następnie napełnij elektrodę roztworem pipetowym zawierającym 1 mM dopaminy. Potem zamontuj ją w uchwycie pipety na prawym manipulatorze. Pamiętaj, aby owinąć folią aluminiową pojemnik z roztworem pipetowym zawierającym dopaminę i przechowywać go w lodzie, gdy nie jest on używany.
Ponieważ dopamina ulega utlenianiu, przechowywanie roztworu w lodzie i w ciemności zmniejszy tempo utleniania. Wsuń srebrny drut do uchwytu elektrody, a następnie nakręć adapter parametryczny na uchwyt elektrody. Następnie napełnij elektrodę trójfunkcyjną wystarczającą ilością rtęci, aby nawiązać kontakt ze srebrnym drutem.
Po zamontowaniu elektrody do adaptera należy obejrzeć pod mikroskopem włókno węglowe o niskim poziomie szumów pro CFE oraz elektrodę parametryczną, aby upewnić się, że końcówka jest czysta i nieuszkodzona. Należy trzymać za dalszy koniec włókna węglowego, aby chronić jego końcówkę przed uszkodzeniem. Następnie zamontuj elektrodę pro CFE Tric.
Następnie zamocuj zmontowaną elektrodę w lewym manipulatorze hydraulicznym, aby sprawdzić integralność elektrody tric. Opuść ją do szalki Petriego z szklanym dnem zawierającej roztwór zewnętrzny. Zarejestruj prąd bazowy w obecności dopaminy.
Następnie dodaj do naczynia 10 µL roztworu dopaminy o stężeniu 1 mM. Prawidłowo działająca elektroda amperometryczna powinna zarejestrować wzrost prądu utleniania. Należy pamiętać o sprawdzeniu sprawności elektrody amperometrycznej przed i po przeprowadzeniu eksperymentów.
W tej procedurze należy wyjęć z inkubatora szalkę Petriego z dnem szklanym zawierającą neurony dopaminergiczne lub komórki zmodyfikowane w celu ekspresji transportera dopaminy. Komórki lub neurony dopaminergiczne należy delikatnie przemyć trzykrotnie ciepłym roztworem zewnętrznym. Aby zwizualizować komórki i przeprowadzić eksperyment, należy umieścić szalkę Petriego z dnem szklanym na stoliku mikroskopu i ustawić odpowiednią ogniskową, aby wyraźnie widzieć komórki.
Następnie przyłóż dodatnie ciśnienie do elektrody patch. Używając strzykawki o pojemności jednego mililitra, delikatnie wprowadź obie elektrody do roztworu i przybliż je do komórki za pomocą mikromanipulatorów. Następnie ustaw elektrodę amperometryczną po lewej stronie komórki, a elektrodę patch po prawej.
Gdy elektroda patch styka się z komórką, zastosuj lekkie zasysanie za pomocą ust lub strzykawki, aby utworzyć tzw. giga seal na komórce. Następnie przerwij uszczelnienie poprzez zasysanie, aby uzyskać konfigurację whole-cell, i odczekaj od pięciu do ośmiu minut na dializę wewnętrznego roztworu zawierającego dopaminę do wnętrza komórki.
Następnie zarejestruj prądy zależne od DAT, zmieniając napięcie błony komórkowej w zakresie od −60 do +100 mV, przy potencjale utrzymującym wynoszącym −40 mV, podawanym przez pipetę. Aby wyznaczyć specyficzny strumień dopaminy zależny od DAT, zarejestruj prądy empiryczne w obecności i przy braku antagonisty DAT. Specyficzny prąd zależny od DAT wyznacza się następnie poprzez odjęcie śladów zarejestrowanych w obecności antagonisty DAT od śladów empirycznych zarejestrowanych bez antagonisty.
Odchylenie w górę prądów tric odpowiada zewnętrznemu strumieniowi dopaminy pokazanemu tutaj. Prądy pośredniczone przez DAT zarejestrowane poprzez skokowe zmiany napięcia błony o 20 mV w zakresie od -60 do +100 mV z potencjałem spoczynkowym -4 C mV przy użyciu pipety zawierającej 2 mM dopaminy w trybie whole cell patching. Poniżej znajduje się prąd amperometryczny nabyty jednocześnie z prądem whole cell.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak mierzyć transport wsteczny dopaminy poprzez transporter dopaminy w neuronie w warunkach zaciskania napięcia. Pamiętaj o sprawdzeniu szczelności elektrody parametrycznej przed i po eksperymentach oraz nie zapomnij odjąć śladów zarejestrowanych w obecności tego antagonisty od śladów zarejestrowanych bez antagonisty.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje technikę pomiaru transportu zwrotnego dopaminy w neuronach z wykorzystaniem jednoczesnego zastosowania metody patch clamp oraz pyrometrii. Metoda ta pozwala na ocenę uwalniania dopaminy za pośrednictwem transportera dopaminy (DAT) przy jednoczesnej kontroli napięcia neuronu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Dynamika neuroprzekaźników
Wstęp
- Dopamina jest kluczowym neuroprzekaźnikiem biorącym udział w różnych funkcjach mózgu.
- Transporter dopaminy odgrywa kluczową rolę w regulacji poziomu dopaminy.
- Zrozumienie mechanizmów transportu wstecznego jest niezbędne dla uzyskania wglądu w sygnalizację dopaminergiczną.
- Technika ta łączy metodę clampy napięciowej z pomiarami amperometrycznymi w celu zwiększenia dokładności.
Cel badania
- Pomiar transportu zwrotnego dopaminy w neuronach z clampowanym napięciem.
- Zbadanie związku między aktywnością DAT a uwalnianiem dopaminy.
- Przedstawienie metody badania funkcji neuronów dopaminergicznych w czasie rzeczywistym.
Zastosowane metody
- Testowanie szczelności elektrody pyrometrycznej z wykorzystaniem dopaminy.
- Uzyskanie konfiguracji whole-cell w neuronie przy użyciu pipety patch.
- Kontrolowanie napięcia komórki za pomocą pipety patch.
- Rejestracja uwalniania dopaminy pośredniczonego przez DAT przy użyciu elektrody pyrometrycznej.
Główne wyniki
- Pomyślny pomiar uwalniania dopaminy podczas clampingu napięciowego.
- Wykazano wpływ blokerów DAT na transport dopaminy.
- Dostarczono informacji na temat mechanizmów regulacyjnych transportu dopaminy.
- Zwalidowano metodę badania neuronalnej dynamiki dopaminy.
Wnioski
- Technika ta pozwala na skuteczne pomiary transportu wstecznego dopaminy.
- Jednoczesna kontrola napięcia pozwala na lepsze zrozumienie funkcji DAT.
- Metoda ta może zostać zastosowana w dalszych badaniach nad sygnalizacją dopaminergiczną.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta metoda umożliwia bezpośredni pomiar odpływu dopaminy poprzez transporter dopaminy w warunkach kontroli napięcia, dostarczając wglądu w mechanizmy funkcjonowania transportera istotne dla odkrywania leków neuropsychiatrycznych. Dzięki izolacji uwalniania zależnego od DAT w czasie rzeczywistym, metoda ta wspiera walidację celu i pozwala zminimalizować ryzyko związane z hipotezami dotyczącymi sygnalizacji dopaminergicznej w modelach chorób. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania leków poprzez powiązanie aktywności transportera z dynamiką neuroprzekaźników.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne Etapy Odkrywania i Walidacja Celu
- Wartość naukowa: Analizuje mechanizm odpływu transportera dopaminy w celu potwierdzenia funkcjonalnego zaangażowania celu w żywych neuronach.
- Wartość operacyjna: Umożliwia jednoczesną rejestrację elektrofizjologiczną i amperometryczną w celu skorelowania potencjału błony z przepływem dopaminy zależnym od transportera.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe, rozdzielone w czasie odczyty prądu utleniania, które odzwierciedlają zależne od DAT uwalnianie dopaminy przy kontrolowanych skokach napięcia.
- Wartość operacyjna: Ustanawia powtarzalny format analizy do pomiaru efektu wysyłania zapośredniczonego przez transporter, co wspiera przesiewanie związków w poszukiwaniu modulatorów DAT.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy aktywność efektora DAT z pozakomórkową homeostazą dopaminy, dostarczając wiedzy dla modeli chorób, w których zaangażowana jest dysfunkcja transportera.
- Wartość operacyjna: Zapewnia istotny w kontekście chorobowym system do oceny genetycznych lub farmakologicznych zaburzeń funkcji transportera dopaminy.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesne etapy procesów odkrywania leków, umożliwiając mechanistyczną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów związanych z transporterem dopaminy przed rozpoczęciem prac nad identyfikacją związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów odwracania kierunku transportu oraz wyjaśnianie szlaków w neuronach dopaminergicznych.
- Screening: Dostarcza gotowe do analizy, ilościowe wyniki służące do oceny wpływu związków na efflux zależny od DAT.
- Analityka: Umożliwia jednoczesne pomiary prądu całokomórkowego i pomiary amperometryczne w celu wyizolowania sygnałów specyficznych dla DAT poprzez subtrakcję farmakologiczną.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez modelowanie dysregulacji dopaminy w neuronalnych systemach sterowanych napięciem.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny funkcji transporterów w wielu modelach neuronalnych lub kontekstach chorobowych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez bezpośredni pomiar zależnego od effluxu uwalniania dopaminy w warunkach fizjologicznej kontroli napięcia.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację analizy dzięki synchronizacji techniki patch clamp i amperometrii, co redukuje zmienność pomiarów strumienia neuroprzekaźników.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez wyjaśnienie mechanizmu działania transportera, co zmniejsza odsetek niepowodzeń w późnych fazach badań wynikających z niezrozumienia mechanizmu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków ukierunkowanych na DAT w oparciu o dostosowany do ryzyka model danych o funkcjonalnej modulacji effluxu.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy z zakresu elektrofizjologii, amperometrii i hodowli neuronów w celu zachowania integralności elektrod oraz wierności sygnału.
- Zależy od niskoszumnej aparatury, w tym manipulatorów hydraulicznych, podwójnych wzmacniaczy Axopatch 200B oraz elektrod z włókna węglowego do jednoczesnej rejestracji.
- Wymaga standaryzacji protokołów napięciowych i metod odejmowania antagonistów pomiędzy zespołami w celu zapewnienia porównywalności eksperymentów.
- Obejmuje kwestie adaptacyjne dla różnych modeli neuronów, szczególnie w odniesieniu do poziomów ekspresji transportera dopaminy oraz kondycji błon komórkowych.
- Uwzględnia ograniczenia praktyczne, takie jak utlenianie roztworu dopaminy, co wymaga ostrożnego obchodzenia się z odczynnikiem oraz walidacji linii bazowej przed i po eksperymentach.
