Zrozumienie formowania wzorców w móżdżku

Nazywam się Kathy Millan. Jestem adiunktem na Uniwersytecie w Chicago w Katedrze Genetyki Ludzkiej oraz w Katedrze Neurologii. Zajmuję się rozwojem mózgu, a konkretnie rozwojem móżdżku, części mózgu znajdującej się z tyłu czaszki.

Jest ono najbardziej znane z roli w rozwoju motorycznym, ale okazuje się, że bierze udział w wielu procesach. To naprawdę interesująca część mózgu. Formowanie wzorca to proces powstawania wzorca w systemie biologicznym. Jest to jedno z tych pojęć, których biolodzy rozwoju używają w sposób dość elastyczny, aby określić niemal wszystko.

I nie jest do końca jasne, co to właściwie oznacza. Myślę, że każdy biolog rozwoju podałby inną wersję tego, co to dla mnie znaczy. Chodzi o to, w jaki sposób mózg, a w szczególności móżdżek, odróżnia górę od dołu oraz w jaki sposób definiuje lewą i prawą stronę.

W jaki sposób decyduje się, która część struktury stanie się konkretnym elementem? A gdy zostaną już podjęte te krytyczne, fundamentalne decyzje we wczesnym embrionie, w jaki sposób wszystkie struktury komórkowe łączą się, by utworzyć precyzyjnie wzorzec spośród części mózgu, którą nazywamy móżdżkiem? Interesuje nas zatem rozwój móżdżku oraz informacje o wzorcowaniu w rozwijającym się móżdżku.

Ponieważ móżdżek jest tkanką o niezwykle precyzyjnej strukturze. Posiada on niewiele warstw komórkowych i niewielką liczbę typów komórek. Zatem w porównaniu z innymi częściami mózgu jest to struktura stosunkowo prosta.

Ponadto móżdżek pełni bardzo specyficzną funkcję, a jedną z jego wielu funkcji jest koordynacja ruchowa. Gdy u myszy lub ludzi występują nieprawidłowości w obrębie móżdżku, jednym z wynikających z tego fenotypów jest brak koordynacji ruchowej. W związku z tym, na przestrzeni około stu lat genetyki myszy, odkryto i w pewnym stopniu scharakteryzowano wiele spontanicznych mutantów myszy, ale istnieją również linie z zaburzeniami ruchowymi, które zostały jedynie wyizolowane i przechowywane w Jackson Labs.

Sądzę, że u dużej liczby tych myszy, prawdopodobnie u ponad 60 szczepów spontanicznych, występują nieprawidłowości w rozwoju móżdżku. Ten zasób jest niezwykle cennym i bogatym źródłem informacji o mechanizmach rozwojowych, które napędzają formowanie wzorca móżdżku. Jednym z obszarów, na których skupia się moje laboratorium, jest wykorzystanie wszystkich narzędzi uzyskanych z Projektu Poznania Ludzkiego Genomu oraz Projektu Poznania Genomu Mysiego i użycie tych reagentów molekularnych do zidentyfikowania genów, które uległy mutacji u wszystkich tych mutantów spontanicznych.

Identyfikując te mutanty, stosujemy podejście skoncentrowane na fenotypie w poszukiwaniu genów. Nie wybieramy zatem genów w sposób losowy, aby je wyciszyć. Poszukujemy fenotypów, a następnie odpowiadających im genów, ponieważ dzięki takiemu podejściu znajdujemy konkretnie te geny, które są szczególnie istotne dla badanego układu.

Zatem nasze laboratorium, podobnie jak wiele innych, sklonowało szereg tych spontanicznych mutantów mysich. Mutanty te doprowadziły do odkrycia niezwykle interesujących aspektów biologii, ponieważ stosujemy podejście oparte na analizie fenotypu.

Nie przyjmujemy żadnych założeń co do tego, jakie geny uda nam się znaleźć. Nie szukamy konkretnie analogów dal ho ani mutacji kanałów. Docieramy do genów, które wynikają z obserwowanych fenotypów.

Dzięki temu dowiadujemy się wielu nowych rzeczy z zakresu biologii. Na przykład jednym z genów lub fenotypów, nad którymi pracowało moje laboratorium, a wraz z którym pracowałem w czasie stażu podoktorskiego z innym kolegą, Jimem Linigiem, był mutant mysi zwany dre, co po niemiecku oznacza wirujący, podobnie jak bączek. Te mutanty mysie pojawiły się po raz pierwszy w 1929 roku w Niemczech i były gromadzone w Jackson Labs.

Istnieje wiele alleli tego konkretnego locus i wiadomo było, że móżdżek był błędnie uformowany. Zatem wszystkie typy komórek móżdżku były obecne, ale wzorzec budowy móżdżka był nieprawidłowy. Środkowa część była nieobecna; ta środkowa część nazywa się verus.

Odkryliśmy, że u tych myszy występował wczesny fenotyp embrionalny, który prowadził do wspomnianego fenotypu u osobników dorosłych. Fenotyp ten był wynikiem mutacji w genie zwanym LMX1A, który oznacza limb homeodomain containing box 1. Gen LMX1A okazał się niezwykle interesującym i ważnym genem w biologii rozwoju, ponieważ jest jednym z najbardziej krytycznych genów określających, co w ośrodkowym układzie nerwowym znajduje się na górze lub w części grzbietowej.

Bez tej rzadkiej mutacji nikt w rzeczywistości nie wiedział, za co odpowiada ten gen. W rzeczywistości został on zidentyfikowany z innych powodów w komórkach trzustki produkujących insulinę, a inni badacze analizowali jego potencjalną rolę w cukrzycy.

Okazuje się jednak, że sam proces starzenia LMX1a nie odgrywa żadnej roli w rozwoju trzustki ani w rozwoju komórek wysepek. W rzeczywistości jego główną funkcją w rozwoju jest sterowanie wzorcowaniem grzbietowym w ośrodkowym układzie nerwowym. Kiedy po raz pierwszy sklonowaliśmy gen DR, czyli gen LMX1a, zdaliśmy sobie sprawę, że jest on ekspresowany wyłącznie w części grzbietowej ośrodkowego układu nerwowego.

W rzeczywistości nie jest ono ekspresjonowane wyłącznie w części grzbietowej ośrodkowego układu nerwowego ani w płytce dachowej, która znajduje się w okolicach móżdżku. Jest ono w istocie ekspresjonowane w części grzbietowej ośrodkowego układu nerwowego wzdłuż całej osi embrionu myszy. Co więcej, jest ono ekspresjonowane wzdłuż całej osi każdego kręgowca, którego do tej pory badaliśmy.

Ponieważ jest ono wyrażane grzbietowo w każdym miejscu, wywnioskowaliśmy, że musi ono pełnić rolę grzbietową w innych częściach ośrodkowego układu nerwowego. Poświęciliśmy zatem dużo czasu na charakterystykę fenotypu myszy DR w rdzeniu kręgowym, ponieważ rdzeń kręgowy jest w rzeczywistości znacznie lepszym systemem modelowym do zrozumienia rozwoju OUN niż móżdżek, gdyż jest on znacznie mniej skomplikowany pod względem trójwymiarowym. Posiada on znacznie mniej złożoną strukturę trójwymiarową.

Przechodząc do modelu kurczaka, mogliśmy wykorzystać szeroką gamę odczynników, aby ustalić rolę LMX1A w rdzeniu kręgowym. Następnie z rdzenia kręgowego powróciliśmy do badania móżdżka. Szczerze mówiąc, uważam, że bez technologii manipulacji u kurczaka nie mielibyśmy pełnego zrozumienia funkcji genu LMX1A; osobą, która faktycznie przeprowadziła te eksperymenty i doprowadziła je do końca, był postdok w moim laboratorium, Victor Chiko.

To on w rzeczywistości odkrył funkcję genu LMX1A oraz jego główną rolę w ośrodkowym układzie nerwowym, wykorzystując system elektroporacji u kurcząt. Szczerze uważam, że nie udałoby nam się poczynić tak dużych postępów, gdyby nie elektroporacja u kurcząt. Elektroporacja u kurcząt jest niezwykle wartościową technologią, ponieważ pozwala na szybką nadekspresję genów w rozwijającym się układzie nerwowym pisklęcia, uzyskanie wyników po dwóch lub trzech dniach inkubacji oraz otrzymanie fenotypów nadających się do analizy.

Gdyby chcieć przeprowadzić manipulacje genowe u myszy w celu uzyskania zwierząt transgenicznych, zajęłoby to kilka miesięcy, a w przypadku nokautów i innych modyfikacji — co najmniej półtora roku. Dlatego system zarodka kurczaka jest niezwykle wartościowy, ponieważ pozwala na szybką manipulację ekspresją genów i szybką identyfikację fenotypów. Przykładowo, nadekspresja genu LMX1 w rozwijającym się układzie nerwowym kurczaka, w szczególności w rozwijającym się rdzeniu kręgowym, spowodowała, że cała grzbietowa część ośrodkowego układu nerwowego lub rdzenia kręgowego przekształciła się w grzbietową część ośrodkowego układu nerwowego, czyli płytkę dachową.

W połączeniu z szeregiem innych eksperymentów przeprowadzonych przez Victora wykazało to, że sam LMX1A odpowiada za sterowanie całym programem różnicowania płytki dachowej. Jest to istotne, ponieważ płytka dachowa stanowi krytyczne centrum sygnalizacyjne w rozwijającym się układzie nerwowym. Bez płytki dachowej nie dochodzi do wydzielania morfogenów, które informowałyby sąsiednie komórki rurki nerwowej o konieczności przekształcenia się w grzbietowe neurony sensoryczne.

A bez tych sygnałów komórki te przechodzą w stan domyślny pośredniego typu komórkowego. W efekcie dochodzi do utraty większości neuronów grzbietowych w rdzeniu kręgowym, ale również w rozwijającym się móżdżku. Sądzę, że nie udałoby nam się łatwo dojść do tego wniosku, korzystając z jakiegokolwiek innego systemu poza czerpioną z kurczaka rurką neuralną.

Jesteśmy bardzo zainteresowani rozwojem móżdżku, nie tylko ze względu na podstawową biologię w systemach mysich oraz kurzych, ale także dlatego, że u ludzi występują malformacje móżdżku. Te ludzkie malformacje móżdżku są bardzo słabo poznane. Dlatego w ramach współpracy z kolegą, dr. Williamem Dobbinsem, jednym z światowych ekspertów w dziedzinie ludzkich malformacji mózgu, wspólnie zainicjowaliśmy projekt mający na celu znalezienie genów odpowiedzialnych za ludzkie malformacje móżdżku.

Stosujemy kilka różnych podejść. Jednym z najważniejszych działań było stworzenie bazy danych DNA oraz bazy klinicznej, do której zakwalifikowaliśmy ponad 500 pacjentów z określonymi ludzkimi malformacjami móżdżku; zebraliśmy obrazy z rezonansu magnetycznego (MRI) i powiązaliśmy je z próbkami DNA, tak abyśmy mogli wykorzystać te zasoby w poszukiwaniu genów, ponieważ okazuje się, że ludzkie malformacje móżdżku nie są wcale dobrze skategoryzowane. Szczerze mówiąc, uważam, że na każde 10 skanów, które otrzymujemy w ramach naszych badań, przynajmniej jeden przedstawia malformację, która nigdy nie została opisana i wcześniej nie była rozpoznawana.

Najczęstszą malformacją móżdżku u ludzi jest malformacja Dandy-Walkera, która jest najlepiej rozpoznawana przez klinicystów. Okazuje się jednak, że jest to swoiste „pojęcie zbiorcze” w świecie ludzkich wad móżdżku. Wielu lekarzy klasyfikuje każdy stwierdzony nieprawidłowy budowa móżdżku jako malformację Dandy-Walkera.

W związku z tym rekrutujemy pacjentów do naszego badania nad malformacją Dandiego-Walkera, w ramach którego odkrywamy różnorodne, interesujące wady rozwojowe móżdżku. Wykorzystujemy ten zasób do poszukiwania nowych genów odpowiedzialnych za rozwój móżdżku, ponieważ jako biolog rozwoju uważam, że ludzie są jednym wielkim eksperymentem mutagennym. Stanowią oni doskonałe źródło do identyfikacji nowych genów rozwojowych.

Stosujemy kilka podejść w celu zidentyfikowania tych genów. Jednym z nich jest analiza genów, których rolę w rozwoju móżdżku ustaliliśmy u myszy, a następnie sekwencjonowanie tych genów u ludzi. W rzeczywistości niedawno zidentyfikowaliśmy pierwszą mutację genu LMX1A u człowieka.

Do tej pory zastosowania naszych podstawowych badań naukowych w badaniach klinicznych były bardzo ograniczone. Jednak sytuacja ta zmienia się bardzo szybko. W miarę odkrywania kolejnych genów możemy dostarczać nowe informacje w ramach poradnictwa genetycznego dla rodzin dotkniętych dzieci.

I szczerze mówiąc, właśnie tutaj widzę największy wpływ naszych badań. Moja wizja tej dziedziny w perspektywie pięciu lat zakłada, że odkrytych zostanie znacznie więcej genów, zarówno dzięki charakterystyce modeli mysich, jak i badaniom nad ludzkimi malformacjami móżdżku. Będziemy wiedzieć więcej o zbiorze genów zaangażowanych w rozwój móżdżku.

Następnie celem będzie ustalenie, w jaki sposób geny te wchodzą ze sobą w interakcje oraz jak napędzają one właściwe procesy biologiczne. W jaki sposób sterują wszystkimi różnymi zdarzeniami komórkowymi, które zachodzą podczas tworzenia móżdżku? Uważam, że móżdżek jest idealnym modelem dla całego ośrodkowego układu nerwowego, ponieważ szczerze mówiąc, wyróżnia się w nim tylko od pięciu do siedmiu głównych typów komórek neuronalnych.

Są one rozmieszczone w różnorodny, stereotypowy sposób. Coraz więcej wiemy o cząsteczkach, które napędzają specyfikację i wczesne różnicowanie tych progenitorów. Coraz lepiej rozumiemy, w jaki sposób komórki te proliferują.

Sądzę, że zajmie to więcej niż pięć lat, ale docelowo widzę możliwość przejścia od rozwoju cewy poprzez rozwój móżdżku, aż do uzyskania dojrzałej formy móżdżku. Uważam, że ponieważ móżdżek jest stosunkowo prostym układem, mamy nadzieję na faktyczne zidentyfikowanie cząsteczek i zdarzeń rozwojowych, które napędzają formowanie się całego móżdżku. Myślę, że jest to niezwykle ważne nie tylko dla dziedziny diagnostyki genetycznej u ludzi i dla dziedziny rozwoju móżdżku, ale uważam, że znajdziemy również zastosowania tych mechanizmów w odniesieniu do innych części mózgu.

Móżdżek jest stosunkowo prostą strukturą, jednak wiele zdarzeń rozwojowych nie ogranicza się wyłącznie do tego obszaru. Wiedzę zdobytą na przykładzie móżdżku możemy przenieść na inne, bardziej złożone regiony ośrodkowego układu nerwowego, takie jak kora mózgowa, a następnie przeanalizować poznane mechanizmy i szlaki sygnałowe, aby ustalić, w jaki sposób odnoszą się one do pozostałych części mózgu.