Śledzenie i pomiar zachowania C. elegans

Fenotypowanie. Lokomocja C. elegans jest ważnym narzędziem w odkrywaniu genów i neuronów zaangażowanych w zachowania C. elegans. C. elegans wykazują stereotypowe zachowania lokomocyjne, takie jak ruchy do przodu i do tyłu oraz różne rodzaje skrętów poprzez zmianę kształtu ciała. Aby ilościowo ocenić te ruchy na długich dystansach oraz z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową, zbudowaliśmy system śledzenia nicieni (worm tracker), aby rejestrować ruch C. elegans podczas pełzania po powierzchni płytki agarowej.

Opracowaliśmy również oprogramowanie do izolowania i ilościowej analizy tych ruchów z wykorzystaniem dedykowanych programów napisanych w środowiskach LabVIEW i MATLAB. Wyzwaniem wszystkich systemów śledzenia wideo jest generowanie ogromnej ilości danych o wysokiej wymiarowości. Nasz program do przetwarzania obrazów i analizy danych radzi sobie z tym problemem poprzez redukcję kształtów nicieni do zestawu niezależnych komponentów, dzięki czemu kompleksowo zrekonstruowaliśmy zachowanie nicieni jako funkcję zaledwie trzech do czterech wymiarów.

Szalka agarowa jest oświetlona światłowodowym źródłem światła i obrazowana za pomocą kamery. System ten jest zamontowany na stole translacyjnym XY. Stół jest przesuwany przez standardowe silniki krokowe, które są podłączone do sterownika silników krokowych.

Kontroler i kamera są podłączone do komputera i sterowane za pomocą dedykowanych programów napisanych w środowisku LabVIEW. Kamera obrazuje powierzchnię płytki z agarem i identyfikuje ciemne obiekty na jasnym tle. Znak kalibracyjny dla procesu automatycznej kalibracji tworzy się poprzez nakłucie powierzchni agaru.

Za pomocą wycieka do nicieni dostosowuje się jakość obrazu w taki sposób, aby program komputerowy mógł kwantyfikować obiekty w czasie rzeczywistym. Można regulować wzmocnienie, jasność oraz czas naświetlania kamery, aby uzyskać ciemny obiekt na białym tle. Możliwa jest również weryfikacja przefiltrowanego obrazu binarnego, z którego korzysta program śledzący.

Oprogramowanie posiada funkcję autokalibracji, która oblicza macierz kalibracyjną poprzez przemieszczenie obiektu testowego na stałą odległość. Odległości wyrażone w pikselach są kalibrowane względem kroków wykonanych przez silnik krokowy za pomocą macierzy kalibracyjnej.

Po kalibracji system jest gotowy do pracy i nie wymaga ponownej kalibracji, chyba że zmieni się powiększenie lub zostanie zmieniona pozycja kamery. Aby ograniczyć ruchy nicieni i zapobiec ich migrowaniu do krawędzi płytki, należy zastosować miedziany pierścień. Najpierw podgrzej pierścień, umieszczając go na bloku grzewczym lub urządzeniu o podobnym działaniu.

Pierścień należy podgrzewać przez około minutę. Umieść pierścień na świeżej płytce z agarem i lekko dociśnij, aby osadzić go w powierzchni agaru. Płytka z agarem wypełniona buforem NGM zostanie użyta do wypłukania resztek pożywki z nicieni w stadium L4 oraz młodych dorosłych.

Po przeniesieniu nicieni do buforu NGM należy pozostawić je w nim przez kilka minut. Ostrożnie umieść jednego z przemytych nicieni na płytce do śledzenia, w pobliżu środka pierścienia. Płytka ta zostanie później wykorzystana w systemie śledzenia nicieni.

Umieść przygotowaną płytkę na stole urządzenia do śledzenia nicieni. Uruchom program LabVIEW i w razie potrzeby wybierz odpowiednie opcje, takie jak lokalizacja zapisu obrazów, rodzaje obrazów, pomiary oraz ustawienia kamery. Używając joysticka, przesuń mikroskop tak, aby obraz nicienia znalazł się w polu widzenia na ekranie komputera.

Następnie naciśnij track, aby uruchomić program śledzenia. Tutaj pokazujemy nicienia śledzonego w czasie rzeczywistym. Program komputerowy mierzy ruchy na obrazach z filtrowaniem binarnym, tak jak pokazano, i może dokonywać pomiarów tego obrazu w czasie rzeczywistym.

Po śledzeniu można zrekonstruować globalną trajektorię na podstawie ruchów silnika krokowego, podczas gdy lokalne zmiany kształtu nicienia można zaobserwować szczegółowo. Nicienie poruszają się pełzając za pomocą ruchów falujących. Rejestrujemy te ruchy poprzez szkieletyzację nicienia do pojedynczej krzywej środkowej, a następnie opisujemy tę krzywą jako zestaw kątów.

Następnie rozkładamy szkielety na ich podstawowe kształty, znane również jako wektory własne. Wykorzystując te mody własne, możemy zrekonstruować kształty nicieni i ilościowo określić ich ruchy. Używając dwóch pierwszych modów, jesteśmy w stanie precyzyjnie uchwycić fazę cyklu falowania nicienia, co przedstawiono na drugim panelu.

Pierwszy panel przedstawia wspólny rozkład modów pierwszego i drugiego, wyróżniając kołowy cykl graniczny. Przesunięcie fazowe w jednym kierunku odpowiada ruchowi do przodu, a przesunięcie fazowe w przeciwnym kierunku odpowiada ruchowi do tyłu. Zatem prędkość fazowa odpowiada prędkości nicola.

W przestrzeni rzeczywistej silna korelacja fazy i prędkości w świecie rzeczywistym jest widoczna na ostatnim panelu. Wykorzystując prędkość fazową wyznaczoną z modu własnego, możemy odkryć subtelne szczegóły zachowania elegancji morskiej, które mogłyby zostać przeoczone przy obserwacji wzrokowej. Na przykład wspólny rozkład prędkości fazowej i fazy wyraźnie wskazuje, że nicienie opuszczają i wchodzą w stan przedni preferencyjnie w określonych fazach ruchu.

W niniejszej pracy zaprezentowaliśmy łatwy w obsłudze system śledzenia, który rejestruje szczegółowe obrazy zachowania splotników podczas pełzania po powierzchni płytek ACA. Ilość informacji zawartych w tych obrazach jest ogromna i wielowymiarowa, dlatego opracowaliśmy również metodę redukcji wymiarowości danych do czterech podstawowych miar. Miary te są łatwe do interpretacji w odniesieniu do zachowania nicieni.

Niniejsza praca została opracowana w celu pomiaru zachowania nicieni przy niewielkich modyfikacjach, a system może być również wykorzystany do pomiaru aktywności neuronalnej z wykorzystaniem regionów genetycznie kodowanych. Cały system charakteryzuje się elastyczną konstrukcją i może być stosowany z innymi systemami do badania pełzania, takimi jak Doof law czy LOEs.