Oznaczanie toksyczności β-amyloidu z wykorzystaniem transgenicznego modelu C. elegans

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest ocena toksyczności beta-amyloidu w modelu InVivo. Powtarzalność i względna prostota tego testu umożliwiają szybkie badanie wpływu leków, warunków środowiskowych lub modyfikacji genetycznych na toksyczność beta-amyloidu. Kluczowym czynnikiem w opracowaniu tego testu jest wytworzenie transgenicznych nicieni C. elegans z indukowalną temperaturą ekspresją beta-amyloidu specyficzną dla mięśni.

Ta ekspresja wrażliwa na temperaturę jest projektowana poprzez konstrukcję transgenu zawierającego nienaturalnie długi niekodujący region 3', co sprawia, że mRNA transgenu staje się celem systemu nadzoru mRNA. Ekspresja tego transgenu jest zatem słaba u nicieni typu dzikiego z funkcjonalnym systemem nadzoru mRNA z powodu degradacji mRNA transgenu. Jeśli transgen ten zostanie wprowadzony do tła genetycznego zawierającego mutację w istotnym komponencie systemu nadzoru mRNA, ekspresja transgenu będzie znacznie wyższa. Jeśli tło genetyczne zawiera mutację wrażliwą na temperaturę w systemie nadzoru mRNA, to namnażanie tego szczepu transgenicznego w temperaturze niepermissywnej zablokuje degradację mRNA transgenu i doprowadzi do wysokiej ekspresji transgenu. Nicienie transgeniczne wykorzystujące ten system do regulacji ekspresji peptydu beta-amyloidu w mięśniach ściany ciała poddane podwyższeniu temperatury z 16 °C do 25 °C wykazują wysoką akumulację peptydu beta-amyloidu, dysfunkcję komórek mięśniowych oraz paraliż nicieni, co pozwala na pomiar czasu.

Czas, po którym populacja tych transgenicznych nicieni ulega paraliżowi po podwyższeniu temperatury, stanowi czuły test toksyczności beta-amyloidu. Osiąga się to poprzez przygotowanie świeżych płytek z podłożem do hodowli nicieni (NGM) do testu paraliżu, co pozwala zminimalizować wpływ zmiennych środowiskowych na wskaźniki występowania paraliżu.

W drugim kroku inicjuje się populacje robaków transgenicznych o zsynchronizowanym wieku, co minimalizuje wpływ etapu rozwojowego na ekspresję transgenu. Następnie zsynchronizowane osobniki w trzecim stadium larwalnym są przenoszone z temperatury 16 °C do 25 °C, co zwiększa stabilność mRNA transgenu i prowadzi do akumulacji peptydu beta-amyloidu. Pomiar czasu od podwyższenia temperatury do wystąpienia paraliżu u każdego robaka pozwala określić tempo dysfunkcji mięśni, a tym samym ocenić toksyczne efekty akumulacji peptydu beta-amyloidu; uzyskane wyniki wykazują wpływ konkretnych zabiegów na toksyczność endogennie wyrażanego peptydu beta-amyloidu.

Główną zaletą naszej techniki, w przeciwieństwie do wykorzystania transgenicznych modeli mysich do oceny aktywności leku, jest to, że możemy przeprowadzić ją znacznie szybciej i przy znacznie mniejszym nakładzie kosztów. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa. Punktacja dla nicieni w stadium L4 w teście paraliżu jest bardzo trudna do opanowania.

Podczas oceny paraliżu u robaka w stadium L4, należy zwrócić uwagę na odizolowany ruch „halo” w obszarze głowy zwierzęcia. Jeśli głowa wykazuje taki ruch, podczas gdy reszta ciała robaka pozostaje sparaliżowana, uznajemy go za sparaliżowanego. Testy paraliżu są przeprowadzane na płytkach ze standardową pożywką NGM (nematode growth media), rutynowo stosowaną do hodowli i badań genetycznych C. elegans.

Aby przygotować płytki, należy wysterylizować w autoklawie roztwór NGM zawierający chlorek sodu, agar i peptyd w kolbie Erlenmeyera, a następnie dodać odpowiednie ilości następujących sterylnych roztworów, które można znaleźć w załączonym protokole pisemnym. Odmierzyć 10 mililitrów ciekłego NGM do każdej płytki Petriego o wymiarach 60 milimetrów na 15 milimetrów. Pozostawić NGM do zastygnięcia przez noc w temperaturze pokojowej.

W przypadku badania wpływu związków lub ekstraktów, nanieś odpowiednią porcję ekstraktu na każdą płytkę i za pomocą rozprzestrzeniacza rozprowadź go równomiernie po całej powierzchni płytki. Pozostaw płytki do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej. Objętości przekraczające 1 ml będą wymagały więcej czasu na wyschnięcie.

Następnie na każdą płytkę nanieś kropelkowo 250 µL szczepu E. coli OP 50 wyhodowanego w pożywce LB przez noc do gęstości optycznej 0,4–0,6 i pozostaw bakterie do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej. Wiek płytki ma istotny wpływ na wskaźnik paraliżu, a starsze płytki mają tendencję do przesychania. Płytki powinny zostać przygotowane w ciągu jednego tygodnia przed wykonaniem testu paraliżu.

W idealnym przypadku należy używać płytek, które zostały zalane od trzech do czterech dni przed synchronicznym zniesieniem jaj; wszystkie płytki wykorzystywane w danym eksperymencie powinny pochodzić z tej samej partii. Zmiana rozmiaru trawnika i/lub rodzaju bakterii wpłynie również na zachowanie nicieni. Testy paraliżu można przeprowadzać z użyciem alternatywnych szczepów E. coli. Na przykład w eksperymentach RNAi stosuje się szczep HT115, co jednak może zmienić kinetykę testu paraliżu.

W związku z tym należy zastosować odpowiednie kontrole wewnętrzne dla danej szczepu. Szczep CL 476 jest najczęściej wykorzystywany do oceny paraliżu indukowanego przez beta. Ten szczep oraz inne modele transgeniczne są dostępne dla badaczy akademickich za symboliczną opłatą w Saint Ahadi Genetic Center.

W celu maksymalizacji synchronizacji wieku populacji testowej zaleca się rozpoczęcie od zsynchronizowanego pokolenia rodzicielskiego. Na tydzień przed rozpoczęciem testu paraliżu populacji testowej, używając platynowej pęsety do nicieni, przenieś od 20 do 30 dorosłych osobników w stadium grave na kilka 10 centymetrowych płytek NGM.

Rozsiać z OP 50 na dwie godziny w celu składania jaj w temperaturze 16 °C, która jest temperaturą dopuszczalną dla CL 4 1 76. Usunąć dorosłe osobniki GR i pozwolić potomstwu rosnąć przez siedem dni, po których staną się dorosłymi osobnikami w drugim dniu grawidacji. Drugi dzień grawidacji.

Do przygotowania populacji testowych o zsynchronizowanym wieku dla każdego wariantu doświadczalnego wykorzystuje się osobniki dorosłe. Celem jest przygotowanie trzech powtórnych płytek zawierających od 50 do 75 zsynchronizowanych wiekowo nicieni przy użyciu platynowej pęsety do nicieni. Przenieś od 10 do 12 dorosłych osobników w drugim dniu rozwoju na 60 milimetrowe płytki NGM z naniesioną hodowlą OP 50. Pozostaw nicienie do złożenia jaj w temperaturze 16 °C przez dwie godziny, następnie usuń osobniki dorosłe i pozwól jajom wykluć się oraz rozwijać w temperaturze 16 °C.

Na tym etapie najlepiej, aby osoby niebiorące udziału w ocenie szalek dokonały ich zakodowania, tak aby analiza wyników była ślepa względem warunków eksperymentalnych. Stadium rozwoju embrionalnego w momencie zniesienia jaj, które dla robaków typu dzikiego w optymalnych warunkach odpowiada w przybliżeniu stadium 26 komórek, jest funkcją wieku i odżywienia osobników dorosłych. Jeśli osobniki dorosłe wykorzystane do zniesienia jaj będą starsze lub głodzone, zniesione zostaną jaja w późniejszym stadium rozwoju, co uniemożliwi uzyskanie synchronicznej populacji, wpływając tym samym na kinetykę testu paraliżu.

Kluczowe jest stosowanie monogenicznych kultur bakteryjnych, takich jak e coli OP 50, ponieważ zanieczyszczenie bakteriami dowolnego rodzaju może poważnie wpłynąć na ten test. Powtarzalność jest najwyższa, jeśli na płytkach powtórzonych trzykrotnie znajduje się podobna liczba nicieni. Aby indukować transgene i przeprowadzić test paraliżu, należy zwiększyć temperaturę inkubacji płytek do 25 °C.

48 godzin po zakończeniu synchronicznego znoszenia jaj, nicienie powinny znajdować się w trzecim stadium larwalnym. Płytki należy ułożyć w inkubatorze w temperaturze 25°C, unikając ich piętrowania, aby mogły osiągnąć tę temperaturę. Jednocześnie należy rozpocząć ocenę paraliżu nicieni od 18 do 20 godzin po zainicjowaniu podwyższenia temperatury.

Na tym etapie wszystkie nicienie w populacji powinny osiągnąć czwarte stadium larwalne; należy kontynuować ocenę w odstępach dwugodzinnych, aż wszystkie nicienie na każdej z płytek zostaną sparaliżowane. Z nieznanych przyczyn paraliż nie obejmuje całego ciała równomiernie. Region głowy jest ostatnią częścią nicienia, która przestaje się poruszać.

W związku z tym nicienie, u których niedawno wystąpił paraliż, nie są w stanie przemieszczać się po płytce, lecz mogą poruszać głowami, oczyszczając w ten sposób obszar z bakterii wokół przedniej części ciała i pozostawiając aureolę oczyszczonych bakterii. Nicienie te nieuchronnie ulegną całkowitemu sparaliżowaniu, dlatego osobniki z aureolami są klasyfikowane jako sparaliżowane. Niektóre nicienie nie będą miały aureoli, ale również nie wykażą spontanicznego ruchu.

Próbki te testuje się, dotykając ich wybierakiem do nicieni. Jeśli dotknięty nicień nie wykazuje pełnej propagacji fali ciała po pobudzeniu, zostaje on również uznany za sparaliżowany w celu sprawnego przeprowadzenia oceny. Najłatwiej jest przenieść sparaliżowane nicienie do nieoznaczonego sektora płytki, aby uniknąć ich niezamierzonego ponownego przeliczenia podczas kolejnego okresu oceny.

Pozwala to również błędnie skategoryzowanym nicieniom na wykazanie ruchu, co umożliwia korektę punktacji w celu wygenerowania krzywej paraliżu. W każdym punkcie czasowym frakcja nicieni na każdej płytce, które nie zostały sparaliżowane, jest przeliczana na procent, a średni procent niesparaliżowanych osobników nanosi się na wykres w funkcji czasu, licząc od momentu rozpoczęcia przesunięcia temperatury (upshift). Otrzymana krzywa jest formalnie analogiczna do krzywej przeżywalności i może zatem być analizowana przy użyciu standardowych nieparametrycznych statystyk przeżywalności.

Przeszczepienie transgenicznych nicieni myo-3 Aβ musi zostać przeprowadzone do połowy stadium L4, aby doszło do inicjacji paraliżu. Promotor Myo-3 jest regulowany rozwojowo. Po osiągnięciu przez nicienie późnego stadium L4 lub wieku dorosłego, poziom ekspresji ulega znacznemu obniżeniu.

Ekspresja transgenu jest blokowana w przypadku głodzenia nicieni, dlatego niezwykle istotne jest, aby zwierzęta były dobrze karmione przez cały czas trwania eksperymentu. Nigdy nie zaobserwowano, aby sparaliżowany nicień powrócił do sprawności w żadnych warunkach. Po 12 do 16 godzinach Upshiftu szczep CL 41 76 zostanie sparaliżowany, niezależnie od tego, czy zostanie przeniesiony do temperatury 16°C; w szczepie CL 41 76 nadekspresja transgenu powodująca paraliż może wystąpić w niższych temperaturach.

Należy jednak pamiętać, że czas wystąpienia paraliżu może być różny. Tempo paraliżu zależy od konkretnego szczepu transgenicznego. Skonstruowaliśmy trzy szczepy myo A beta, w których tempo paraliżu jest szybsze lub wolniejsze niż w przypadku szczepu CL 41 76, dlatego należy odpowiednio dostosować okno czasowe oceny w teście paraliżu.

Przedstawiono tutaj wykres krzywej paraliżu dla szczepu CL 4 1 76, zarówno nieleczonego, jak i poddanego działaniu 6,27 millimolarnej kofeiny. Zabieg ten skutkuje wysoce istotnym statystycznie opóźnieniem paraliżu o około cztery godziny, co interpretujemy jako przejaw supresji toksyczności beta. W tym modelu eksperyment ten służył do oceny efektów innego związku występującego w kawie.

Wykres jest typowy dla zabiegów, które nie wpływają na toksyczność beta. Należy zauważyć, że w obu eksperymentach około połowa nieleczonych populacji CL 4 1 76 jest sparaliżowana po 24 godzinach, a paraliż jest całkowity po 28 godzinach. Są to typowe ramy czasowe dla paraliżu grupy kontrolnej.

W populacjach CL 4 1 7 6 istotne odchylenia od tego czasu świadczą o zmienionych warunkach środowiskowych lub spontanicznej delecji kopii transgenu. Dodatkowe informacje na temat szczepu CL 4 1 76 znajdują się w towarzyszącym protokole. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby brać pod uwagę wiek płytek, stadium populacji nicieni oraz zdolność do oceny wskaźnika paraliżu nicieni.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobre wyobrażenie o tym, jak wykorzystać ten system z wykorzystaniem morskich alg do dokładnego badania toksyczności beta-amyloidu. Będą Państwo w stanie wykryć dość subtelne efekty różnorodnych zabiegów środowiskowych lub farmakologicznych na tę toksyczność. Zmienne, o których wspomnieliśmy, są istotne i wymagają uwagi, ponieważ umożliwią one przeprowadzenie analizy w sposób wysoce powtarzalny i z zachowaniem spójnej kinetyki paraliżu.

Jest to w rzeczywistości dość istotne, jeśli chcą Państwo porównać wyniki uzyskane w swoim laboratorium w różnym czasie przez różne osoby lub porównać własne wyniki z wynikami innych badaczy korzystających z tego modelu systemowego.