Próbkowanie peptydomu ludzkiej śliny z wykorzystaniem sondy ultrafiltracyjnej o kształcie lizaka: uproszczenie i usprawnienie detekcji peptydów w klinicznej spektrometrii mas

Niniejsze badanie peptydów śliny wykorzystuje sondę do ultrafiltracji typu „lollipop” (LLUF), a następnie bezpośrednią analizę nano LC-LTQ MS. Najpierw należy złożyć sondę LLUF, używając membrany z polieterosulfonu oraz rurki z etylenu i propylenu. Następnie należy pobrać próbki śliny od ochotników i przetworzyć je za pomocą sondy LLUF w celu pobrania próbki śliny.

Następnie należy przejść bezpośrednio do nano L-C-L-T-Q spektrometrii mas i przeanalizować dane z próbek śliny z zastosowaniem oraz bez zastosowania sondy LLUF. Ostatecznie peptyd śliny można uzyskać poprzez analizę danych L-C-M-S-S i porównanie zidentyfikowanych peptydów między obiema próbkami. To podejście, wykorzystujące ultrafiltracyjną sondę w kształcie lizaka w połączeniu z bezpośrednią analizą nano lc LTQ spektrometrią mas, oferuje kluczowe zalety w porównaniu z innymi metodami, takimi jak trawienie białek śliny do peptydów.

Następnie przeprowadzono analizę spektrometrią mas. LUF PRO upraszcza i oczyszcza ślinę, a także zwiększa detekcję peptydów metodą MS w całej ślinie do zastosowań klinicznych. Za pomocą kleju epoksydowego przyklejono membrany polieterowe do krawędzi trójkątnych łopatek z polipropylenu. Następnie do wylotu cylindra trójkąta przyłączono rurkę z fluorowanego etylenu propylenu (Teflon).

Łopatki z polipropylenu. Sondy należy wysterylizować 70% alkoholem przez noc. Aby ocenić szczelność uszczelnienia, zanurzyć sondy LLUF w roztworze niebieskiego dekstranu o stężeniu 50 mg/mL na dwie godziny. Potwierdzić brak niebieskiego dekstranu w pobranych próbkach.

Zrekrutuj zdrowych ochotników w wieku od 20 do 40 lat. Po przepłukaniu jamy ustnej wodą poproś badanego o wyplucie próbek śliny pełnej do naczynia chłodzonego w lodzie. Połącz wszystkie próbki i przechowuj je w lodzie.

Bezpośrednio po pobraniu próbki należy przenieść 200 µL śliny do pomieszczenia o temperaturze 4 °C w celu przeprowadzenia pobierania próbek za pomocą sond LLUF. Następnie należy zanurzyć polieterową membranę do filtracji w ludzkiej ślinie w naczyniu hodowlanym. Aby zasymulować proces ultrafiltracji podczas pobierania próbki ze śliny, należy wytworzyć podciśnienie, odciągając tłok strzykawki.

Następnie należy oznaczyć stężenia białek. Przygotować próbki białek ze śliny w stężeniu 1 µg/µL do analizy metodą nano LC-MS. Do analizy próbek wykorzystujemy system exigent nano LC sprzężony online ze spektrometrem mas Finnegan LTQ. W pierwszej kolejności należy za pomocą autosamplera nanieść 5 µL nieprzetrawionych próbek śliny na kolumnę pułapkową (trap column) systemu nano LC.

Po etapie płukania przełącz zawór i podaj liniowy gradient buforu B od 0 do 50% na pułapkę oraz kolumnę rozdzielczą C 18. Korzystając z trybu zależnego od danych (data dependent mode) urządzenia Excalibur, zbierz widma ms ms dla czterech najsilniejszych jonów MS o intensywności powyżej 1×10⁴. Dla każdej próbki przeprowadź podwójne analizy trzech różnych, oddzielnych preparatów.

Następnie zaimportuj plik z danymi do systemu Sequester Sorcerer 2, wybierając wyszukiwanie w odpowiedniej ludzkiej bazie białek NCBI z zastosowaniem opcji non-enzyme specificity. Po przeprowadzeniu wyszukiwania w programie Sequester wyniki są automatycznie filtrowane, walidowane i wyświetlane w profilach peptydowych (peptide profit) oraz białkowych (protein profit) na podstawie uzyskanych rezultatów. Profil peptydowy szacuje kompleksowy wynik prawdopodobieństwa P (P score), określający, czy przypisanie peptydów jest poprawne, czy błędne, a także identyfikuje dodatkowe informacje dotyczące każdej sekwencji peptydowej.

Protein profit oblicza wynik prawdopodobieństwa od zera do jednego dla każdego białka na podstawie peptydów przypisanych do widm Ms.Ms. Niniejsza sekcja określa zdolność sond LLUF do usuwania bakterii jamy ustnej w celu hodowli do detekcji bakteryjnej; próbki śliny przed i po pobraniu sondą LLUF nanosi się na płyty agarowe w celu testu bakterii tlenowych. W przypadku bakterii tlenowych należy stosować płyty z agarem LB bez antybiotyków w temperaturze 37 °C przez jedną dobę, a w przypadku bakterii beztlenowych należy do hodowli wykorzystać system gas pack.

Próbkę inkubowano na pożywce BRU, na płytkach z agarem w warunkach beztlenowych w temperaturze 37 °C przez jeden dzień. Konstrukcja urządzeń do ultrafiltracji przypominających lizaka ułatwia pobieranie próbek śliny w symulowanym środowisku jamy ustnej. W tym systemie ujemnie naładowana membrana z polieterosulfonu o progu odcięcia masy cząsteczkowej 30 kDa jest przyklejona do polipropylenowej łopatki i umieszczona przed sondą LLUF w celu odfiltrowania większych białek zawartych w ślinie.

Aby naśladować środowisko jamy ustnej człowieka, gąbkę nasącza się śliną za pomocą strzykawki. Ślina jest filtrowana i zbierana przez podłączony przewód. Porównanie chromatogramów lc śliny przed i po pobieraniu prób LLUF pozwoliło na identyfikację endogennych peptydów śliny za pomocą nano L-C-L-T-Q spektrometrii mas.

Ponieważ te chromatogramy różnicowe są uzyskiwane bez trawienia chemicznego lub enzymatycznego, upraszczają one przygotowanie próbek do celów klinicznych. W tej próbce, po wyjaśnieniu LLUF w odniesieniu do różnych składów białkowych, zidentyfikowano 131 peptydów w nietrawionej ślinie.

Peptydy te są fragmentami pochodzącymi z różnych białek bogatych w prolinę. Aktyna, amylaza alfa, globin alfa-1, globina beta, histona 1, keratyna 1, mucyna 7, polimeryczny receptor immunoglobuliny serynowej oraz S 100. Unikalne peptydy zidentyfikowane w ślinie po filtrowaniu za pomocą sond LLUF to fragmenty pochodzące głównie z różnych białek bogatych w prolinę.

Ten peptyd pochodzący z alfa-amylazy został wykryty wyłącznie w próbce śliny pobranej bez użycia sond LLUF, co obrazuje zdolność sond LLUF do usuwania dużych białek. Co najbardziej interesujące, po usunięciu większych białek, w ślinie pobranej za pomocą sondy LLUF można było wykryć kilka sekwencji peptydowych; w szczególności w próbkach po ultrafiltracji sondami LLUF zidentyfikowano peptydy z bogatymi w prolinę końcami C. Powinni Państwo teraz posiadać wystarczającą wiedzę na temat tego, jak wykorzystać A-L-L-L-L-U-F PRO do analizy masy w prostych próbkach śliny.

Właściwa analiza jest bardzo ważna dla pobrania i prostego przygotowania śliny w jednolitych warunkach. Uważam, że po opanowaniu tej techniki może ona być prawidłowo wykonana w ciągu trzech godzin. Takie podejście z wykorzystaniem sondy do ultrafiltracji w formie lizaka, połączone z bezpośrednią analizą nano L-C-L-T-Q-M-S i spektrometrią masową, ułatwia zastosowania kliniczne biomarkerów w diagnostyce chorób ludzkich.