Synteza na fazie stałej funkcjonalizowanego bis-peptydu z wykorzystaniem metodologii „safety catch”

Ogólnym celem następnego doświadczenia jest synteza funkcjonalizowanego peptyd BSP z wykorzystaniem technik syntezy na fazie stałej. Osiąga się to poprzez osadzenie chronionego aminokwasu BIS na żywicy kwasu hydroksyetylobenzoenowego. Następnie powtarza się cykle sprzęgania z głęboką ochroną w celu przyłączenia funkcjonalizowanych aminokwasów bis, co prowadzi do wydłużenia peptydu BIS i wprowadzenia pożądanej funkcjonalności.

Na koniec pierwszy bis-aminokwas jest modyfikowany alfa-aminokwasem w celu odszczepienia peptydu BIS z żywicy poprzez tworzenie DI-ketopirazyny. Uzyskane wyniki wykazują pomyślną syntezę funkcjonalizowanego peptydu BSP o dobrej czystości surowej i powtarzalnej wydajności izolowanej na poziomie około 10% w oparciu o analizę za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej z spektrometrią mas. Znaczenie tej techniki rozciąga się na równoległą syntezę oraz tworzenie bibliotek peptydów bis, ponieważ peptydy BIS są montowane na stałej żywicy, co pozwala na łatwiejszą manipulację niż w przypadku reakcji w roztworze, a produkty uboczne są łatwo usuwane poprzez filtrację.

Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ wiele etapów jest trudnych do opanowania ze względu na liczne istotne szczegóły, które są niezbędne, aby zapewnić maksymalny stopień kompletności wszystkich reakcji. W syntezie na fazie stałej nie ma możliwości oczyszczania produktów pośrednich. Dlatego, aby uzyskać czysty produkt końcowy, każda reakcja musi zostać doprowadzona do możliwie pełnego przereagowania.

Zalecamy stworzenie listy kontrolnej procedur eksperymentalnych, aby uniknąć pomyłek, ponieważ kroki mają charakter powtarzalny. Niniejszy protokół rozpoczyna się od załadowania pierwszego peptydu BSP, ochrony pierwszego peptydu BSP oraz jednoczesnego blokowania (cappingu) żywicy. Aby rozpocząć, należy załadować pierwszy peptyd BSP, odważając 114 mg żywicy H-M-B-A-A do naczynia reakcyjnego o pojemności 8 ml i dodając magnetyczny mieszadło.

Zamknij górną część naczynia gumowym septem i przedmuchaj rurkę argonem przez co najmniej pięć minut. W międzyczasie przygotuj roztwór aktywowanego aminokwasu BIS zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Po zakończeniu czynności pokazanych w tym filmie, przenieś roztwór do naczynia reakcyjnego za pomocą strzykawki i mieszaj w atmosferze argonu przez noc; następnego dnia usuń septem i zlej mieszaninę reakcyjną.

Przemyj żywicę, dodając do niej około dwóch mililitrów chlorometanu. Mieszaj przez 30 sekund do minuty, a następnie odlej ciecz. Powtórz ten proces czterokrotnie z użyciem DCM, a następnie przemyj żywicę pięciokrotnie dimetyloformamidem.

Aby przeprowadzić głęboką ochronę pierwszego bis-aminokwasu oraz jednoczesne blokowanie końców żywicy, powoli dodaj do naczynia reakcyjnego 2 mL roztworu 33% bromku wodoru w kwasie octowym i DCM. Pozostaw do mieszania przez 15 minut, a następnie odlej ciecz i pięciokrotnie przemyj żywicę w DCM. Powtórz sekwencję ochrony D jeszcze raz.

Następnie żywicę przemywa się pięciokrotnie w DCM, a potem pięciokrotnie w DMF, po czym neutralizuje się ją, przemywając dwukrotnie 5% roztworem objętościowym D-I-P-E-A w DMF. Następnie ponownie przemywa się ją pięciokrotnie w DCM i pięciokrotnie w DMF. Teraz można przeprowadzić sprzęganie chronionego, funkcjonalizowanego bis-aminokwasu.

W pierwszej kolejności należy ponownie wprowadzić atmosferę obojętną do naczynia reakcyjnego zawierającego żywicę, przemywając je trzykrotnie bezwodnym DCM. Następnie należy założyć septum oraz podłączyć linię z argonem, a naczynie przemyć, dodając od 1 do 2 ml bezwodnego DCM i mieszając przez 30 sekund. Po tym czasie należy opróżnić naczynie, aż poziom cieczy w bulgotce linii argonowej zacznie się podnosić.

Powtórz ten proces przynajmniej raz jeszcze. Następnie przygotuj roztwór funkcjonalizowanego bis-aminokwasu w osuszonej nad płomieniem probówce w atmosferze argonu. Dodaj 47 µL DIC i mieszaj przez 90 minut.

Następnie do żywicy dodać 35 µL D-I-P-E-A w 666 µL bezwodnego DMF i mieszać przez kolejne pięć minut. Przenieść wcześniej aktywowany roztwór aminokwasu BIS do naczynia za pomocą strzykawki i mieszać przez noc aż do następnego dnia. Odlać mieszaninę reakcyjną i przemyć dwukrotnie bezwodnym DCM w atmosferze argonu.

Kluczowym etapem tej procedury są sprzęgania biz-aminokwasowe. Aby zapewnić zamknięcie pierścienia diketopiperazyn, stosujemy dłuższy czas reakcji z dodatkiem czynników aktywujących. W celu wspomagania zamykania diketopirazyny, należy dodać roztwór HOAT i DIC, a następnie mieszać pod osłoną argonu przez jedną godzinę.

Następnie należy usunąć septum i zlać mieszaninę reakcyjną. Żywicę należy przemyć pięć razy DCM oraz pięć razy DMF. Niniejsza sekcja obejmuje głęboką ochronę funkcjonalizowanej aminokwasu BIS, głęboką ochronę F moc oraz acylację pierwszego aminokwasu BIS.

Aby przeprowadzić głęboką ochronę chronionego funkcjonalizowanego bis-aminokwasu, powoli dodaj dwa mililitry roztworu TFA i TIPS do naczynia reakcyjnego i mieszaj przez jedną godzinę; po odlaniu cieczy przemyj żywicę DCM przez około 30 sekund, a następnie odlej i powtórz przemywanie DCM pięć razy. Następnie powtórz całą sekwencję przemywania żywicy po głębokiej ochronie, stosując cykl płukania A-D-C-M-D-M-F. Zneutralizuj żywicę, przemywając ją dwukrotnie 5% objętościowo roztworem D-I-P-E-A w DMF.

Następnie przeprowadź kolejne przemywanie w sekwencji D-C-M-D-M-F. Na tym etapie peptyd BIS można wydłużyć za pomocą innych funkcjonalizowanych bis-aminokwasów, funkcjonalizować go na prowadzącym azocie kwasu karboksylowego lub w obu tych wariantach. Aby usunąć grupę ochronną FM, dodaj 2 mL 20% roztworu piperydyny w DMF i mieszaj mieszaninę reakcyjną przez 20 minut.

Odlać ciecz i pięciokrotnie przemyć żywicę w DMF. Powtórzyć ten proces jeszcze raz po dodatkowym przemyciu żywicy. Aby wyizolować pierwszy bis-aminokwas, dodać przygotowany roztwór aminokwasu do naczynia reakcyjnego i mieszać przez sześć godzin w ramach ostatniego etapu.

Przemyj żywicę pięciokrotnie DCM i pięciokrotnie DMF. Ostatnia część tego protokołu obejmuje usunięcie grupy Bach z aminokwasu związanego z żywicą oraz odszczepienie go z żywicy. Najpierw dodaj do naczynia reakcyjnego 2 mL roztworu TFA-DCM w stosunku 1:1 i mieszaj przez 30 minut.

Odlać ciecz i przemyć żywicę pięciokrotnie w DCM. Następnie powtórzyć ten proces jeszcze raz. Przemyć i odlać ciecz z żywicy przez 30 sekund, pięciokrotnie przy użyciu DCM i pięciokrotnie przy użyciu DMF.

Następnie należy dodać 2 mL roztworu 10% D-I-P-E-A w bezwodnym DMF i mieszać przez 24 do 48 godzin. Na koniec mieszaninę reakcyjną należy zebrać do wcześniej zważonej kolby okrągłodennej. 30 µL tego roztworu należy przenieść do 450 µL Tetra Hydro FU w fiolce do lc MS i przekazać do analizy.

Przemyj żywicę dodatkowymi porcjami DMF i zbierz je do kolby okrągłodennej. W celu monitorowania przekształceń chemicznych na żywicy w trakcie syntezy można zastosować następujące metody. Aby wykryć wolne grupy hydroksylowe, przeprowadź próbę z czerwienią metylową, usuwając najpierw za pomocą jednorazowej pipety około jednego miligrama suchej żywicy.

Przelać do naczynia reakcyjnego o pojemności 4 ml. Dodać roztwór czerwieni metylowej przygotowany zgodnie z opisem w tekście i mieszać przez 5–10 minut. Odlać nadmiar cieczy i przemyć żywicę pięciokrotnie DCM; pomarańczowe lub czerwone kuleczki żywicy wskazują na obecność wolnych grup hydroksylowych.

Test ten można wykorzystać do oceny stopnia obciążenia pierwszego bis-aminokwasu oraz etapu blokowania końców żywicy. W celu wykrycia produktów wtórnych należy przeprowadzić test chloralu, przenosząc około 1 mg suchej żywicy do małej fiolki za pomocą jednorazowej pipety. Należy dodać po trzy krople 0,8 mM roztworu chloralu w DMF oraz 2% roztworu aldehydu kwasowego w DMF.

Następnie pozostawmy próbkę w temperaturze pokojowej od 5 do 10 minut. W tym przypadku niebieskie lub fioletowe koraliki żywicy wskazują na obecność wolnych amin wtórnych w związku związanym z żywicą. Aby potwierdzić wydajność aktywacji, należy przeprowadzić test pułapki aktywacyjnej; stopień aktywacji związku podczas syntezy można ocenić, przenosząc od 5 do 10 µL aktywowanego roztworu do fiolki do chromatografii cieczowej sprzężonej z spektrometrią mas zawierającej 50 µL olaminy i mieszając ręcznie.

Przez kilka sekund roztwór powinien stać się żółty, następnie należy go rozcieńczyć 450 µL tetrahydrofuranu i poddać analizie LC-MS. Produkt końcowy oraz aktywowane produkty pośrednie można ocenić za pomocą systemu LC-MS wyposażonego w kolumnę odwróconej fazy C18 i układ rozpuszczalników woda-acetonitryl z 0,1% kwasu mrówkowego. Ten zapis LC-MS-UV stanowi przykład wysokiej czystości produktu surowego.

Ustalono, że główny pik w widmie występujący w 21,3 minucie posiada masę zgodną z oczekiwaną masą produktu. Można to zaobserwować w widmie mas surowego produktu, gdzie pik wykazuje główne sygnały odpowiadające masie cząsteczkowej, masie z dodatkiem jonu sodu, a także masie pomniejszonej o masę grupy ochronnej IV DDE. Przedstawiono tutaj zapis UV LCMS oczyszczonych widm, wykazujący bardzo czysty produkt w 21,3 minucie, oraz widmo mas potwierdzające tożsamość tego oczyszczonego piku.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykorzystania technik syntezy na stałej fazie do syntezy funkcjonalizowanych bispeptydów po ich opracowaniu. Metoda ta, po opanowaniu, otworzyła badaczom w dziedzinie bispeptydów drogę do eksploracji zastosowań w interakcjach białko-białko oraz katalizie. Przy prawidłowym wykonaniu technika ta pozwala na syntezę funkcjonalizowanego trimeru bispeptydowego w ciągu czterech do pięciu dni.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o tym, aby koraliki pozostawały zanurzone w roztworach reakcyjnych i płuczących w trakcie jej przebiegu. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak wpływ stereochemii lub alternatywnych funkcjonalności na wiązanie białek lub aktywność katalityczną, można zastosować inne metody, np. syntezę równoległą lub syntezę bibliotek. Należy pamiętać, że praca z odczynnikami organicznymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie odpowiedniego sprzętu ochronnego i praca w dygestorium.