Analiza wychwytu powinowactwa w fazie ciekłej z użyciem kulek magnetycznych do badania oddziaływań białko-białko: przykład poliwirusa i nanoprzeciwciała

Niniejszy protokół wykorzystuje oddziaływanie między poliovirusem a nanociałami rozpoznającymi poliovirusa w celu zademonstrowania prostego ilościowego testu wychwytu powinowactwa w fazie ciekłej. W zasadzie zastosowano kuleczki magnetyczne powlekane kobaltem do wyciszania białek z etykietą oraz wszelkich oddziałujących z nimi białek znakowanych promieniotwórczo. Najpierw wymieszaj białka znakowane i etykietowane, a następnie inkubuj je w temperaturze pokojowej.

Następnie dodaje się kuleczki magnetyczne rozpoznające znacznik, a następnie oddziela frakcję związanego białka znakowanego od frakcji niezwiązanej za pomocą magnesów. Następnie mierzy się sygnał białka znakowanego obecnego w frakcji niezwiązanej i określa jego ilość w tej frakcji. Wyniki z tego analizy powinowactwa w fazie ciekłej są niezwykle użyteczne podczas badania białek wrażliwych na konwersję konformacyjną.

Ten test powinowactwa w fazie ciekłej pozwala na analizę oddziaływań między nanociałami rozpoznającymi poliwirusa a różnymi antygenami poliwirusa. Metodę tę można zastosować również do innych oddziaływań białko-białko, pod warunkiem że jedno z białek może zostać znakowane, a drugie wykryte. Pierwsze doświadczenia z tą metodą zdobyliśmy podczas badań nad oddziaływaniami między nanociałami rozpoznającymi poliwirusa a różnymi antygenami poliwirusa.

Ponieważ poliovirus jest wrażliwy na zmiany konformacyjne podczas wiązania z powierzchnią stałą, zastosowanie e LSA jest ograniczone. Dlatego preferowany powinien być system oparty na fazie ciekłej. Przykładem takiego systemu wykorzystywanego często w badaniach nad poliovirusem jest micro protein.

Analiza immunoprecypitacji. Mimo że test ten udowodnił swoją przydatność, wymaga on skrystalizowanej struktury konwencjonalnego przeciwciała, której nanociała nie posiadają. Nanociała, będące interesującymi i bardzo stabilnymi przeciwciałami jednodomenowymi, mogą być łatwo modyfikowane pod kątem różnych sekwencji.

Szeroko stosowany stos białek wykazuje powinowactwo do jonów dwuwartościowych, takich jak nikiel i kobalt, które z kolei mogą być łatwo naniesione na kuleczki magnetyczne. Opracowaliśmy zatem prosty ilościowy test wychwytu powinowactwa oparty na kuleczkach magnetycznych powlekanych kobaltem.

Wymieszaj zapas kulek magnetycznych w wortexie i przenieś 10 µL dla każdej próbki do probówki, a następnie osadź kulki za pomocą magnesu. Usuń przezroczysty nadosad, aby wypłukać kulki. Dodaj 150 µL buforu wiążącego.

Zebrać kuleczki za pomocą magnesu i usunąć nadsącz po drugim przemyciu. Zawiesić kuleczki ponownie w 40 µL buforu wiążącego dla każdej próbki i kontroli. W celu wyznaczenia tła dla próbki pierwszej, przygotować dołek bez wirusa znakowanego radioaktywnie, ale z taką samą objętością buforu wiążącego dla kontroli.

Przygotuj próbkę o 100% radioaktywności. Dodaj wszystkie składniki do dołka, zastępując nanociało buforem wiążącym. Następnie dodaj 2000 zliczeń na minutę poliovirusa szczepu 7 typ 1 znakowanego S 35 do wszystkich próbek, tak aby całkowita objętość bufora wiążącego wynosiła 80 µL.

Przyjąć kontrolę. Próbka pierwsza. Dodać 10 µL rozcieńczenia nanociała do każdej próbki.

Mieszaj dokładnie przez 10 sekund na wytrząsarce i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 40 µL zawiesiny przemytych kulek magnetycznych i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej przy ciągłym wytrząsaniu, odwiruj kulki za pomocą magnesu i przenieś klarowny supernatant do probówki w celu pomiaru radioaktywności każdej próbki, przenosząc 50 µL supernatantu do kolby liczącej. Dodaj trzy mililitry mieszaniny płynu scyntylacyjnego i odczytaj wynik na liczniku.

Wypłucz użyte kuleczki magnetyczne w probówce za pomocą wody i odwiruj przy 500 ×g przez dwie minuty. Odlej nadsącz i ponownie zawieś kuleczki w sześciu mililitrach 0,5 molarnego wodorotlenku sodu. Następnie podziel zawiesinę do kilku probówek i inkubuj w kąpieli ultradźwiękowej przez pięć minut.

Po zebraniu kulek za pomocą magnesu i usunięciu naddatku, do każdej probówki należy dodać jeden mililitr 2% roztworu SDS, a następnie wymieszać za pomocą wortexa i folgować przez pięć minut. Następnie należy odzyskać kulek. Do każdej probówki należy dodać jeden mililitr 0,2 M EDTA o pH 7 i inkubować probówki w kąpieli ultradźwiękowej przez pięć minut.

Następnie zebrać kuleczki, przemyć je trzy razy jednym mililitrem wody, a następnie jednym mililitrem 10 milimolowego roztworu chlorku kobaltu. Umieścić probówki na wytrząsarce na 10 minut. Przejść do zbierania kuleczek za pomocą magnesu i resuspenderować je w jednym mililitrze buforu wiążącego.

Przemyj dwukrotnie w jednym mililitrze 20% etanolu, a następnie resuspenduj kuleczki w ich pierwotnej objętości 20% etanolu, aby uzyskać zregenerowane kuleczki o stężeniu 40 mg/mL. Skoryguj tło radioaktywności, przyjmując próbkę kontrolną jeden jako wartość 0% radioaktywności, a próbkę kontrolną dwa jako wartość 100% radioaktywności.

Następnie dla każdej próbki oblicz procent radioaktywności w nadsączu jako miarę całkowitego wytrącania radioznakowanego wirusa przez nanociało. Niniejszy eksperyment ocenia powinowactwo PVSS 38 C oraz przeciwciała specyficznego dla poliwirusa przy użyciu trzech różnych antygenów poliwirusa: antygenu natywnego, antygenu podgrzanego oraz podjednostek 14 s. Co ciekawe, radioaktywność w nadsączu próbek zawierających radioznakowane podjednostki 14 s maleje wraz ze wzrostem stężenia nanociała PVSS 38 C. Wskazuje to na wzrost ilości podjednostek 14 s poliwirusa związanych z nanociałem PVSS 38 C, a pośrednio z kuleczkami magnetycznymi.

Ponieważ nie zaobserwowano powinowactwa pvs S 38 C do formy N antygenowej oraz H antygenowej poliovirusa, nanociało wydaje się być specyficzne dla podjednostki 14 s poliovirusa. Powinowactwo nanociała do jego antygenów mierzone tą metodą jest specyficzne, w przeciwieństwie do niepowiązanego nanociała NB one, które nie wykazuje reaktywności wobec trzech form antygenowych poliovirusa.

System ten wykazuje wysoką powtarzalność, co potwierdza przedstawiona krzywa dawka-odpowiedź, wygenerowana przez różnych badaczy w różne dni. Po opanowaniu metody ten niezawodny test powinowactwa w fazie ciekłej może zostać prawidłowo przeprowadzony w ciągu dwóch godzin, wliczając w to recykling kulek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać gruntowną wiedzę na temat stosowania tego testu powinowactwa w fazie ciekłej opartego na kuleczkach magnetycznych podczas badania oddziaływań między różnymi białkami, szczególnie w sytuacjach, gdy nie można zastosować systemów opartych na fazie stałej.