Obrazowanie fluorescencyjne NADH w izolowanych, pracujących sercach królika z obiema komorami

Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie metabolizmu. Wykorzystując obrazowanie NADH w preparacie pracującego serca, cel ten realizuje się poprzez wstępne wyizolowanie serca królika. Drugim krokiem procedury jest prawidłowe zakanulowanie wszystkich czterech jam serca w celu uzyskania modelu pracującego serca.

Ostatnim krokiem jest przygotowanie sprzętu obrazującego i zbieranie danych dotyczących NADH przy różnych częstotliwościach stymulacji. W rezultacie obrazowanie fluorescencyjne NADH pozwala na wykazanie zmian metabolicznych w sercu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak perfuzja retrogradowa, jest fakt, że serce pracuje w stanie fizjologicznym, z przepływem w naturalnym kierunku i przy własnym ciśnieniu zapewniającym perfuzję wieńcową.

Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu elektrofizjologii oraz mechanizmów śmiertelnych arytmii. Odbywa się to poprzez zapewnienie modelu fizjologicznego do badania związku między metabolizmem przepływu wieńcowego a aktywnością elektryczną. Wizualna prezentacja tej metody jest istotna, ponieważ etapy kaniulacji naczyń i jam serca są trudne do opanowania.

Nieprawidłowa technika może uszkodzić serce i zagrozić dalszemu przebiegowi eksperymentu. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy wypłukać wszystkie probówki w komorach pracującego układu serca wodą oczyszczoną, a następnie usunąć wodę z układu poprzez uruchomienie pomp. W liniach pompy perfuzyjnej LOR, pompy perfuzyjnej lewej komory serca oraz pompy perfuzyjnej prawej komory serca należy zastosować filtry z membrany celulozowej.

Po dodaniu systemu PERFUSE eight do układu, przeprowadź kalibrację dwupunktową dla każdego czujnika ciśnienia. Włącz podgrzewaną łaźnię wodną z cyrkulacją, która ogrzewa rurki z płaszczem wodnym oraz wymienniki ciepła. Włącz łaźnię wodną używaną do podgrzewania systemu PERFUSE eight.

Włącz pompy krążące PERFUSE eight w obiegu zamkniętym, włącz zbiornik cyrkulacyjny w celu natlenienia Perfuse Eight i upewnij się, że natleniacz z mikrowłókien lub filtry hemo dostarczają 95% tlenu do perfuse eight pod ciśnieniem 80 kilopascals. Na koniec upewnij się, że wymienniki ciepła utrzymują temperaturę krążącego perfuse.

Przy 37 °C rozpoczynij wycinanie serca, ustawiając najpierw system pracy serca w trybie stałego ciśnienia (tryb LRF). Po podaniu królikowi środka uspokajającego ustaw ciśnienie bloku aorty w zakresie od 50 do 60.

Wstrzyknąć pentobarbital i heparynę do żyły brzegowej ucha lub żyły saphenous bocznej na wewnętrznej stronie kończyny tylnej. Gdy u królika ustąpi odruch bólowy, szybko otworzyć jamę klatki piersiowej. Przeciąć osierdzie, zacisnąć aortę i wyciąć serce oraz płuca.

Płuca pozostawia się przytwierdzone, aby ułatwić izolację żył płucnych. Następnie należy napełnić strzykawkę 60 mililitrami PBS oraz 200 jednostkami heparyny. Należy przymocować kaniulę o średnicy pięciu milimetrów i przeprowadzić kaniulację aorty.

Przymocuj aortę do kaniuli za pomocą jedwabnych szwów rozmiaru zero. Następnie powoli naciśnij tłok strzykawki, aby wypłukać krew przez serce. Przygotuj system pracującego serca, podłączając najpierw serce do bloku aorty.

Zbliż się do złącza pod kątem i pozwól, aby Perfuse eight powoli ściekał ze złącza do kaniuli, gdy ta jest podłączona. Zapobiega to przedostawaniu się powietrza do aorty, co przeciwdziała powstawaniu zatorów wieńcowych podczas perfuzji serca w trybie stałego ciśnienia (tryb Langendorfa).

Usuń tłuszcz i tkankę łączną, a następnie zlokalizuj następujące naczynia: żyłę główną dolną i górną, żyłę aortyczną, tętnicę płucną oraz żyły płucne. Następnie podwiąż żyłę główną górną.

Przetnij tętnicę płucną tuż poniżej miejsca jej rozgałęzienia na prawą i lewą tętnicę płucną. Pozostałe naczynia to żyły płucne. Zbierz je w wiązkę między sercem a płucami i podwiąż wszystkie jednym szwem.

Jest to krytyczne z dwóch powodów. Po pierwsze, podwiązanie naczyń połączonych z płucami zapewni brak wycieków po zakończeniu kanulacji. Po drugie, ważne jest odizolowanie obu żył głównych VNA przed późniejszą kanulacją.

Następnie usuń płuca. W narożniku uszka lewego przedsionka wytnij otwór o odpowiedniej wielkości i upewnij się, że jest on wypełniony roztworem perfuse eight. Następnie wprowadź kaniulę do uszka, dbając o to, aby kaniula była całkowicie wypełniona roztworem perfuse eight.

Następnie, przytrzymując tkankę, przyszyj kaniulę do wyrostka. Tkanka wyrostka lewego przedsionka jest niezwykle delikatna i może łatwo ulec rozerwaniu. Dlatego ważne jest, aby kaniulacja lewego przedsionka powiodła się za pierwszym razem, w przeciwnym razie może okazać się ona niemożliwa.

Włącz pompę numer dwa, aby zapewnić przepływ do lewego przedsionka. Ustaw obciążenie wstępne (preload) w zakresie od 2 do 6 tor przez cały czas trwania eksperymentu. Może być konieczne skorygowanie ciśnienia.

Utrzymaj wartość w granicach dwóch milimetrów od ciśnienia docelowego. Teraz przełącz serce w tryb pracy, wyłączając na chwilę pompę numer jeden, pompę płucną. Obniż ciśnienie aorty do 10 mmHg, a następnie powoli zwiększ je do zakresu od 80 do 100 mmHg.

Pozwala to na otwarcie zastawki aortalnej i jej funkcjonowanie w sposób odpowiadający normalnym warunkom fizjologicznym. Za pomocą kaniuli podłączonej bezpośrednio do układu ustaw końcowe ciśnienie obciążenia następczego na wartość wynoszącą około 20 Tore mniej niż maksymalne ciśnienie w LV.

Wprowadź kaniulę do prawego przedsionka przez dolną żyłę główną i przyszyj kaniulę do żyły. Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza. Włącz pompę numer trzy, pompę prawostronną, aby zapewnić przepływ do prawego przedsionka.

Ustaw ciśnienie na około trzy tor. Na koniec wprowadź kaniulę do prawej komory, nie dopuszczając do przedostania się powietrza, a następnie przyszyj kaniulę do tętnicy płucnej. Tym samym zakończono kaniulację dwukomorową.

Przejdź teraz do akwizycji sygnału. Ostrożnie wprowadź cewnik przetwornika ciśnienia do aorty za pomocą kaniuli aortalnej. Delikatnie przesuń go poza zastawkę aortalną do lv.

Sygnał ciśnienia w LV pojawi się zgodnie z oczekiwaniami, gdy końcówka cewnika zostanie prawidłowo ustawiona. Następnie delikatnie dociśnij elektrodę do pomiaru jednofazowego potencjału czynnościowego do epikardium komory. Lekki artefakt ruchowy w sygnale z elektrody jest zjawiskiem normalnym.

Następnie umieść bipolarną elektrodę stymulującą w prawym przedsionku, aby stymulować serce zgodnie z pozycją przewidzianą w planie eksperymentalnym. Następnie ustaw ostrość kamery CCD na obszarze zainteresowania serca. Do kamery powinien być przymocowany filtr emisyjny.

Aby zarejestrować fluorescencję NADH, należy wyłączyć światło zewnętrzne, aby równomiernie oświetlić epikardium źródłem światła UV w stacji roboczej, do której przymocowana jest kamera. Należy ustawić oprogramowanie tak, aby rejestrowało obrazy z częstotliwością dwóch klatek na sekundę. Następnie należy wybrać tryb aktualizacji na żywo, aby monitorować średnią intensywność pikseli w obrębie wybranego obszaru zainteresowania.

Jeśli perfuzja była odpowiednia, poziomy NADH reprezentowane przez fluorescencję powinny być niskie i stabilne na powierzchni epikardium. Po zakończeniu eksperymentu należy usunąć serce.

Opróżnij PERFUSE eight oraz przewody i komory systemu z wody oczyszczonej. Okresowo płucz system roztworem TM do błon śluzowych lub rozcieńczonym roztworem nadtlenku wodoru zgodnie z opisanym protokołem. Serca były stymulowane przy długościach cyklu od 200 do 400 uderzeń na minutę.

Rozkurczowe LVP wynosiło zazwyczaj od 0 do 10 Tor, natomiast minimalne rozkurczowe ciśnienie aortalne wynosiło około 60 Tor. Szczytowe skurczowe LVP zależy od ciśnienia napełniania oraz kurczliwości i optymalnie powinno mieścić się w zakresie od 60 do 80 Tor. Maksymalne ciśnienie aortalne i maksymalne LVP powinny być ze sobą ściśle zgodne. Monofazowe potencjały czynnościowe typowe dla serca królika charakteryzują się szybką fazą depolaryzacji oraz charakterystyczną fazą repolaryzacji. Potencjały czynnościowe były łatwo rejestrowane z preparatów, lecz zazwyczaj występował w nich niewielki artefakt ruchowy podczas rozkurczu.

Średnie wartości fluorescencji NADH z obszaru zainteresowania zaznaczonego czerwonym prostokątem były mierzone w celu monitorowania zmian stanu redoks mitochondriów podczas trzech cykli stymulacji przy długościach cyklu wynoszących odpowiednio 300, 200 i 150 ms, gdy częstość stymulacji była zbliżona do rytmu zatokowego. Poziom bazowy NADH pozostawał stosunkowo stały przy skracaniu długości cyklu. Poniżej 300 ms poziomy bazowe NADH wzrosły, przy czym największy wzrost odnotowano przy 150 ms; sygnał oscyluje w rytm skurczów, a częstotliwość tych oscylacji odpowiada częstotliwości pracy serca.

Amplituda tych oscylacji była zawsze mniejsza niż trendy w dłuższych skalach czasowych wywołane niedokrwieniem lub hipoksją. Wysokorozdzielcze obrazowanie fluorescencyjne NADH całej powierzchni przedniej przy 200 uderzeniach na minutę było stałe i przestrzennie jednorodne przy 400 uderzeniach na minutę. Poziomy NADH wzrosły znacząco w całym epikardium.

Zaobserwowano znaczną heterogeniczność przestrzenną, przy czym największe wzrosty wystąpiły w obszarach przegrodowych RV i LV. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w czasie krótszym niż 45 minut, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procesu. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zapobieganiu przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do aorty lub lewego przedsionka po zakończeniu procedury.

Dodatkowe metody, takie jak obciążenie serca barwnikiem wrażliwym na napięcie, mogą być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na kolejne pytania, np. dotyczące powiązania aktywności elektrycznej i metabolicznej na powierzchni serca w scenariuszach patologicznych, takich jak lokalne niedokrwienie po jego wystąpieniu. Technika ta utorowała drogę badaczom fizjologii serca do studiowania metabolizmu serca i zaburzeń przewodzenia w warunkach patologicznych z wykorzystaniem modelu bardziej istotnego fizjologicznie.