Ilościowy pomiar proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej zależnej od invadopodiów w kontekście jednokomórkowym i wielokomórkowym

Ta standardowa technika pozwala na przygotowanie szkiełek nakrywkowych pokrytych żelatyną znakowaną fluorescencyjnie, które nadają się do ilościowych analiz degradacji macierzy przez inwazyjne podia. Po pokryciu szkiełek nakrywkowych żelatyną znakowaną fluorescencyjnie, należy wysiać komórki i inkubować je w celu degradacji macierzy. Następnie komórki należy utrwalić i zabarwić fluorescencyjnie pod kątem białek markerowych inwazyjnych podiów, a następnie pozyskać obrazy i ilościowo ocenić degradację macierzy.

Typowe wyniki pozwalają na ilościowe określenie różnic w degradacji macierzy pośredniczonej przez podia pomiędzy komórkami poddanymi zróżnicowanej manipulacji wybranymi genami lub traktowaniu środkami farmakologicznymi. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ przygotowanie szkiełek nakrywkowych pokrytych żelatyną z jednorodną fluorescencją jest trudne do osiągnięcia ze względu na nierównomierne pokrycie fluorescencyjną żelatyną lub niewłaściwe obchodzenie się z szkiełkami pokrytymi żelatyną. Procedurę zaprezentują adiunkt Karen Martin, pracownik postdoktorski Mandy Ammer oraz doktoranci Elise Walk, Karen Hayes i Steve Markwell.

Aby przygotować nieoznakowany roztwór zapasowy 5% żelatyny i sacharozy, połączyć żelatynę i sacharozę w PBS i rozpuścić całkowicie w temperaturze 37 °C. Następnie przechowywać w temperaturze 4 °C. Przystąpić do czyszczenia szklanych szkiełek nakrywkowych.

Do każdego dołka plastikowej 24-dołkowej płytki do hodowli tkanek włóż pojedynczy szkiełko nakrywkę, dodaj 500 µL 20% kwasu azotowego i inkubuj przez 30 minut. Po usunięciu roztworu kwasu azotowego przemyj szkiełka nakrywki trzykrotnie wodą dejonizowaną. Następnie przeprowadź powlekanie.

Na każde szkiełko nakraplamy 500 µL roztworu poli-L-lizyny o stężeniu 50 µg/mL i inkubujemy przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Roztwór poli-L-lizyny należy usunąć, a szkiełka przemyć trzykrotnie PBS. Powlekanie poli-L-lizyną ułatwia równomierne pokrycie i wiązanie nakładanej żelatyny znakowanej. Płytki 24-dołkowe należy umieścić w lodzie, a następnie do każdego dołka dodać 500 µL świeżo przygotowanego 0,5% glutaraldehydu.

Następnie inkubuj płytki na lodzie przez 15 minut. Przeprowadź trzy przemycia zimnym PBS, a następnie odessij wszystkie pozostałości PBS przed powleczeniem żelatyną. W międzyczasie, podczas inkubacji z glutaraldehydem, przygotuj roztwór żelatyny koniugowanej z Oregon Green 488.

Zgodnie z protokołem producenta, należy podgrzać ten roztwór oraz nieznakowany 5% roztwór stokowy żelatyny z sacharozą do 37 °C. Następnie należy rozcieńczyć 500 µL znakowanej żelatyny w czterech mL nieznakowanej żelatyny z sacharozą, naniosząc 100 µL tak rozcieńczonej mieszaniny żelatyny 4 88 na każde szkiełko nakrywkowe.

Należy użyć odpowiedniej ilości żelatyny, aby pokryć szkiełko nakrywkowe bez konieczności ręcznego rozprowadzania. Ważne jest, aby podczas procedury powlekania utrzymywać rozcieńczoną mieszankinę żelatyny 4 88 w temperaturze 37°C, aby zapobiec przedwczesnemu stężeniu. Ponadto, od tego etapu wzwyż należy przechowywać szkiełka nakrywkowe w ciemności tak często, jak to możliwe, aby uniknąć potencjalnego fotoblaknięcia.

Po pokryciu wszystkich szkiełek nakrywkowych w jednej płytce, należy trzymać płytkę pod kątem i usunąć nadmiar żelatyny z każdej studni za pomocą aspiracji próżniowej. Następnie inkubować pokryte szkiełka nakrywkowe w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po trzykrotnym przemyciu szkiełek nakrywkowych PBS dodać 500 µL borohydreku sodu.

W wyniku reakcji z borowodorkiem wydziela się gaz i wokół każdego szkiełka nakrywkowego pojawią się małe pęcherzyki; inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby zredukować i dezaktywować resztkowy glutaraldehyd. Usuń roztwór borowodorku sodu poprzez aspirację próżniową, wykonując szybkie ruchy zamiatające wokół krawędzi każdej studzienki. Należy uważać, aby nie odessać pływających szkiełek nakrywkowych, które mogły oddzielić się od dna płytki do hodowli tkankowej podczas obróbki borowodorkiem sodu. Po trzech przemyciach w PBS inkubuj szkiełka nakrywkowe w 70% etanolu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Stosując technikę sterylną, przenieś szkiełka nakrywkowe zawierające płytki do komory z laminarnym przepływem powietrza typu II przeznaczonej do hodowli komórek B, a następnie przemyj szkiełka nakrywkowe trzy razy sterylnym PBS za pomocą sterylnej igły i pęsety. Ostrożnie przenieś szkiełka nakrywkowe do pustej studni nowej płytki 24-dołkowej i doprowadź szkiełka nakrywkowe do równowagi z pożywką hodowlaną dla konkretnego typu analizowanych komórek.

Następnie, po odpowiednim czasie inkubacji, wysiej komórki bezpośrednio na szkiełka nakrywki. Przystąp do obróbki próbek w celu obrazowania immunofluorescencyjnego, aby zamontować preparaty. Nanieś kroplę Prolong Gold Antifade lub podobnego odczynnika na szkiełko przedmiotowe, ostrożnie umieść na nim odwróconą nakrywkę i wykonaj zdjęcia do analizy.

Analiza ta dostarcza znormalizowaną powierzchnię degradacji macierzy w stosunku do powierzchni komórek lub ich liczby. Jest ona przydatna do analizy całych mikroskopowych pól widzenia, w których znajduje się wiele komórek poddanych wspólnej obróbce czynnikami wzrostu irna lub środkami terapeutycznymi. Do tej analizy wykorzystuje się obrazy zebrane przy niższym powiększeniu, wystarczającym do efektywnego gromadzenia informacji o populacjach komórek.

Otwórz obraz w programie ImageJ. Sprawdź informacje o skali i wybierz pomiary. Wybierz opcje obszaru (area) oraz limitu progu (limit to threshold). Oblicz obszar degradacji, korzystając z obrazu fluorescencyjnej żelatyny; skoryguj nierównomierne oświetlenie żelatyny poprzez odjęcie progu tła z obrazu służącego do ustawienia górnych i dolnych wartości intensywności pikseli.

W kolejnych obrazach należy użyć przycisku „set” w oknie progowania, aby ustawić ten sam próg dla wszystkich obrazów, co stanowi obiektywny sposób wyboru obszaru degradacji. Następnie należy użyć funkcji „analyze particles”, aby zmierzyć wartość progu w obszarach degradacji macierzy.

Wybierz rozmiar cząsteczki większy od zera, aby usunąć szum z zaznaczenia. Włącz wyświetlanie konturów, aby zidentyfikować obszary zainteresowania. Następnie zaznacz opcje wyświetlania wyników oraz podsumowania, aby pokazać pomiary, jeżeli na rysunku zostały dokładnie obrysowane wszystkie obszary degradacji.

Skopiuj pomiar całkowitej powierzchni do arkusza kalkulacyjnego; jeśli zaznaczono inne obiekty, takie jak zanieczyszczenia, zapisz jedynie powierzchnie odpowiednich obszarów zainteresowania. Następnie, aby obliczyć powierzchnię komórek, otwórz plik i obraz z barwieniem, a następnie wykonaj progowanie obrazu, aby ustawić górną i dolną wartość intensywności pikseli w taki sposób, aby na kolejnych obrazach zaznaczone zostały krawędzie komórek. Użyj przycisku set w oknie progowania, aby ustawić ten sam próg dla wszystkich obrazów.

Jako obiektywny sposób wyboru obszaru komórek należy użyć funkcji analyze particles, aby zmierzyć próg powierzchni komórek. Wybierz rozmiar cząstki większy od zera, aby usunąć szum z zaznaczonego obszaru.

Wyświetl obrysy, aby zidentyfikować obszary do analizy, sprawdź wyniki wyświetlania i podsumuj, aby pokazać pomiary powierzchni. Nie zaznaczaj. Uwzględnij otwory, jeśli występują przestrzenie między komórkami a klastrem.

Teraz dokonaj wyboru. Skopiuj wyniki powierzchni dla odpowiednich obszarów zainteresowania do arkusza kalkulacyjnego i oblicz powierzchnię degradacji żelatyny w stosunku do całkowitej powierzchni komórek. Alternatywnym podejściem jest normalizacja powierzchni degradacji do liczby komórek, określonej poprzez zliczenie jąder barwionych DAPI.

Jest to istotne, jeśli manipulacje zmieniają średnią powierzchnię komórek. W tym podejściu należy użyć wtyczki nucleus counter do automatycznego zliczania jąder. Dostosuj opcje, aby zoptymalizować je pod kątem swoich obrazów. Jeśli jądra w znacznym stopniu na siebie nachodzą, automatyczne zliczanie może nie zapewnić dokładnej numeracji w takim przypadku.

Przy prawidłowym wykonaniu, ręczne liczenie można ułatwić za pomocą wtyczki do liczenia komórek. Szkiełka podstawowe są równomiernie pokryte żelatyną sprzężoną z Oregon Green 488. Podczas pokrywania i przetwarzania szkiełek pokrytych żelatyną mogą wystąpić liczne artefakty.

Na przykład nierównomierne pokrycie wynika z niewłaściwego zakrycia szkiełka podstawowego podczas procesu powlekania z powodu słabego wymieszania, ręcznego rozprowadzania lub częściowego zestalenia mieszaniny żelatyny. Zarysowania wskazują na usunięcie powlekłej matrycy poprzez nacięcia igłami lub pęsetą podczas manipulacji. Wyschnięcie powierzchni szkiełka podstawowego podczas długotrwałego przechowywania może skutkować wyglądem przypominającym brukowanie. Ten obszar odzwierciedla fotowyblaknięcie fluorescencyjnej powierzchni żelatyny podczas obrazowania w wyniku długotrwałej lub wysokointensywnej ekspozycji na światło.

Zwróć uwagę, że odpowiednio przygotowane szkiełko nakrywki wykazuje jednorodną fluorescencję podczas obserwacji mikroskopowej. Cienkie macierze otrzymywane w wyniku tej procedury stanowią czułe narzędzie do oceny zdolności komórek do degradowania ECM. Na przykład.

Obrazy te przedstawiają aktywność degradacji macierzy podium w procesie inwazji komórki raka głowy i szyi OSC 19. Komórki zasiano na szkiełkach nakrywkowych z żelatyną sprzężoną z Oregon Green 488, a następnie obrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, co przedstawiono na obrazach 2D i 3D. Komórki OSC 19 wysiane na szkiełkach z żelatyną sprzężoną z Oregon Green 488a zostały znakowane rodaminą sprzężoną z Phalloidiną oraz przeciwciałami przeciwko kortaktynie, wizualizowanymi za pomocą wtórnego przeciwciała ANOR 647 i pseudo kolorowanymi na zielono w obszarach inwazji.

Podia są widoczne na scalonym obrazie jako ogniskowe koncentracje cytoplazmatyczne aktyny F i kortyny, które nakładają się na obszary przejaśnienia żelatyny. Wizualizacja przedstawia, w jaki sposób wnikające podia penetrują podobjętość ECMA; stworzono ją, aby ukazać krawędź wewnątrz komórki, w której obecne są wnikające podia. Widok krawędzi grzbietowej demonstruje wnikające podia wstawione w znajdującą się poniżej żelatynę.

Widok krawędzi brzusznej ukazuje wypukłości w podia Veda oraz obszary degradacji żelatyny pod szkiełkiem podstawowym, gdzie regiony czerwone występują w obrębie zielonej matrycy. Obrazy te przedstawiają niektóre z kluczowych etapów kwantyfikacji znormalizowanej degradacji matrycy żelatynowej przez komórki w obrębie całego obrazu mikroskopowego. Wszystkie obrazy fluorescencyjne zostały przekonwertowane na skalę szarości, aby lepiej zobrazować czerwone progi odcięcia oraz oznaczenia obszarów zainteresowania.

Ten obraz żelatyny sprzężonej z Oregon Green 488 pokazuje ciemne obszary, w których nastąpiła degradacja. Dzięki progowaniu obrazu żelatyny wyróżniono obszary degradacji, z których wybrano interesujące regiony w celu pomiaru powierzchni degradacji. Obraz ten przedstawia rumine, foid oraz barwienie f-aktyny zgodnie z oczekiwaniami.

Próg na obrazie aktyny uwidacznia całkowity obszar komórki, z którego wybierane są obszary komórkowe do pomiaru. Podobnie technikę tę można zastosować do badania obrazów jąder komórkowych barwionych DAPI. Ten panel przedstawia wybrane kroki zaangażowane w kwantyfikację degradacji fluorescencyjnej żelatyny przez poszczególne komórki w obrębie mieszanej populacji komórkowej.

Ta prosta kwantyfikacja dotyczy pojedynczej przetransfekowanej komórki OSC 19 nadprodukującej rekombinantową kortaktynę połączoną z epitopem flag. Należy zauważyć, że degradacja macierzy przez komórki przetransfekowane może być analizowana również w mieszanej populacji komórek przetransfekowanych i nieprzetransfekowanych. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o kilku kwestiach.

Najpierw należy upewnić się, że fluorescencyjne markery komórkowe nie pokrywają się z kolorem fluorescencyjnej żelatyny. Podczas gromadzenia obrazów ważne jest wybieranie pól na podstawie obecności komórek. Nie należy celowo wyszukiwać obszarów degradacji, ponieważ może to wprowadzić błąd do danych ze względu na zmienność między liniami komórkowymi i odpowiedzi na różne czynniki terapeutyczne.

Czynniki takie jak liczba próbek, czas degradacji oraz dobór białek do znakowania immunofluorescencyjnego powinny zostać zoptymalizowane pod kątem konkretnego eksperymentu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat przygotowania szkiełek podstawowych równomiernie pokrytych fluorescencyjną żelatyną w badaniach degradacji pośredniczonej przez beta-podia, a także metod ilościowego oznaczania degradacji macierzy.