Badanie proteolizy cykliny B na poziomie pojedynczej komórki w populacjach całych komórek

Celem niniejszej procedury jest monitorowanie wpływu proteolizy cykliny B na rozpoczęcie anafazy i wyjście z mitozy. Jest to realizowane poprzez najpierw wysianie komórek z reporterem snap cykliny B na szkiełkach mikroskopowych. W drugim kroku chimeryczna cząsteczka reportera snap cykliny B jest znakowana fluorescencyjnym substratem TMR star.

Następnie, w stacji mikroskopowej, przeprowadza się akwizycję serii obrazów. Końcowym krokiem jest analiza komórek i obliczenie natężenia fluorescencji TMR star w czasie, co odzwierciedla proteolizę cykliny B. W rezultacie mikroskopia immunofluorescencyjna żywych komórek raportujących pozwala ujawnić kinetykę proteolizy cykliny B zachodzącą podczas mitozy.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak monitorowanie cyclone BGFP, jest to, że cyclone B SNAP umożliwia monitorowanie degradacji cyclone B, a nie ekspresji całego białka. Komórki reporterowe snap do tego eksperymentu są początkowo hodowane asynchronicznie w fazie logarytmicznej przez co najmniej 48 godzin. Na początek, w celu wysiania komórek, stosuje się procedurę z użyciem trypsyny dla subkonfluencyjnych komórek reporterowych snap, aby wysiać je do ośmiogniazdkowych komór mikroskopowych, zapewniając stały rozkład na całej powierzchni komory wirówki.

10 000 komórek i resuspends w 350 µL normalnego medium wzrostowego bez czerwieni fenolowej. Przenieś zawiesinę komórkową do komory mikroskopowej w celu wysiania komórek do ośmiogniazdkowych komór mikroskopowych, zapewniając maksymalną gęstość komórek w centrum komory. W pierwszej kolejności napełnij komorę 300 µL normalnego medium wzrostowego bez czerwieni fenolowej.

Następnie, w celu wysiania komórek na specjalne optyczne płytki 96-dołkowe, ostrożnie dodaj 5 000 komórek do centrum komory mikroskopowej, zapewniając stałą dystrybucję na całej powierzchni dołka. Odwiruj 5 000 komórek i resuspenduj w 300 µL normalnej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej, zależnie od całkowitej liczby wymaganych dołków zawierających komórki. Dostosuj liczbę komórek oraz całkowitą objętość medium zawiesiny.

Następnie przenieś zawiesinę komórek do płytki 96-dołkowej w celu wysiania komórek na specjalne płytki optyczne 96-dołkowe, tak aby uzyskać maksymalną gęstość komórek w centrum dołka. Ostrożnie nanieś 1 500 komórek w 15 µL normalnej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej w postaci małej kropli do centrum każdego dołka.

Dzięki temu wzrost komórek zostanie ograniczony do centrum studzienki. Przed rozpoczęciem procedury barwienia pozwolić wszystkim wysianym komórkom na wzrost przez co najmniej 18 godzin w standardowych warunkach hodowli komórkowej. Podgrzać aliquoty standardowej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej do 37°C.

Substrat snap zastosowany w tej demonstracji to TMR star. W celu łatwiejszej obsługi rozpuszczono TMR star w DMSO, aby uzyskać roztwór zapasowy o stężeniu 400 µM. Następnie 0,5 µl roztworu zapasowego TMR star rozcieńczono w 200 µl podgrzanej, normalnej pożywki wzrostowej wolnej od czerwieni fenolowej, aby uzyskać końcowe stężenie znakowania wynoszące 1 µM. Następnie usunięto normalną pożywkę wzrostową z asynchronicznie rosnących komórek i zastąpiono ją pożywką znakującą. Komórki inkubowano w pożywce znakującej przez 25 minut w standardowych warunkach hodowli.

Po 25 minutach usunąć medium do znakowania i przemyć komórki czterokrotnie ciepłym, normalnym medium wzrostowym bez czerwieni fenolowej. Po ostatnim przemyciu inkubować komórki w 300 microliters ciepłego, normalnego medium wzrostowego bez czerwieni fenolowej przez 30 minut przed transportem do mikroskopu. Wymienić medium na świeże, ciepłe, normalne medium wzrostowe bez czerwieni fenolowej, aby usunąć pozostałości niezwiązanego substratu snaps; transportować komórki do mikroskopu w pudełku styropianowym na wstępnie podgrzanym bloku grzejnym o temperaturze 37 degree Celsius.

Aby zminimalizować wahania temperatury, na dwie godziny przed pomiarem intensywności fluorescencji należy ustawić temperaturę powietrza w komorze klimatycznej na 37 °C w trybie osuszania, aby doprowadzić mikroskop i wszystkie jego komponenty do pożądanej temperatury. W celu uniknięcia kondensacji i wynikającego z niej uszkodzenia mikroskopu, ważne jest przeprowadzenie wstępnego podgrzewania przed ustawieniem wilgotności.

Gdy cały system mikroskopowy osiągnie temperaturę 37 °C, należy ustawić wilgotność powietrza na 60% oraz stężenie dwutlenku węgla na 5%. Uruchom oprogramowanie do skanowania lub akwizycji i zdefiniuj standardowe ustawienia. Określ pozycje studni przeznaczonych do analizy. Zdefiniuj wartość delta T lub czas cyklu akwizycji oraz całkowitą liczbę cykli akwizycji.

W tej demonstracji automatyczny autofocus sprzętowy został wybrany w celu analizy większej liczby studzienek. Rozpocznij akwizycję i nadzoruj pierwsze dwa cykle pozyskiwania danych.

Mikroskop zostanie ustawiony na sygnał GFP histony H2, a następnie zostanie wykonane pierwsze zdjęcie w tym kanale, przed zmianą filtra i wykonaniem odpowiadającego mu zdjęcia TMR star. Procedura ta jest powtarzana dla wszystkich pozycji w obrębie jednej studzienki oraz dla każdej z badanych studzienek przed rozpoczęciem kolejnego cyklu. W celu analizy profili proteolitycznych należy uruchomić oprogramowanie analityczne scan R.

Przeanalizuj obrazy z jądrami komórkowymi uwidocznionymi za pomocą histony H2 GFP, definiując je jako główne obiekty przy użyciu progu opartego na intensywności sygnału oraz algorytmu watershed, aby wspomóc separację sąsiadujących komórek. Do analizy TMR* należy utworzyć subobiekt składający się z jądra wraz z cytoplazmą. Istotnymi właściwościami głównego obiektu są pozycje X i Y, czas oraz maksymalna i średnia intensywność GFP dla głównego obiektu, a także całkowita intensywność podzielona przez powierzchnię.

W przypadku podobiektu TMR star przełącz na tryb śledzenia (trace mode), aby zwizualizować średnią intensywność fluorescencji TMR star podobiektu w czasie lub ślady komórek przypisane do analizowanych obiektów głównych. Analiza większej liczby komórek pozwala na uzyskanie pierwszej reprezentatywnej i obiektywnej oceny, jednak liczbę badanych komórek można ograniczyć, stosując bramkowanie (gating) dla pomiarów trwających co najmniej 140 cykli i charakteryzujących się wysoką maksymalną intensywnością histone H two GFP. Wybierz interesujący ślad komórkowy, aby jednocześnie zwizualizować fluorescencję histone H two GFP oraz TMR star na poziomie pojedynczej komórki.

Używając prawego przycisku myszy, kliknij wybraną komórkę i wygeneruj obraz do eksportu. Galeria ilustrująca histone H2 GFP oraz cycling B snap TMR star dla każdego punktu czasowego. Przełącz oprogramowanie analityczne skanera w tryb populacyjny i zaznacz obszar na wykresie kropkowym (dot blot), w którym znajduje się wybrana komórka.

Zastosuj nowe okno wykresu kropkowego (dot plot) do bramowanego obszaru i zwizualizuj średnią intensywność fluorescencji TMR star w czasie. Eksportuj dane do programu Microsoft Excel w celu przeprowadzenia dalszych obliczeń. Przedstawione tutaj ryciny obrazują kinetykę cykliny B, reprezentowaną przez krzywą intensywności fluorescencji TMR star komórki przechodzącej przez prawidłową mitozę, bez oznak nieprawidłowego ułożenia chromosomów podczas kondensacji cytoplazmy po rozpadzie otoczki jądrowej (NEBD), co zaznaczono czerwonym trójkątem; intensywność fluorescencji TMR staph wykazuje gwałtowny wzrost aż do momentu osiągnięcia okna izomorficznego.

Gdy komórka wchodzi w prometafazę, intensywność fluorescencji utrzymuje się na stabilnym poziomie, dopóki komórka przechodzi przez profazę i metafazę, a następnie zaczyna gwałtownie spadać. Gdy wszystkie chromosomy utworzą stabilną płytkę metafazową, spadek ten poprzedza separację chromosomów. Podczas anafazy, zaznaczonej niebieską kropką na krzywej w późnej mitozie, chromatyna zaczyna się dekondensować, a komórka przyjmuje morfologię charakterystyczną dla tej fazy.

Podczas gdy krzywa intensywności fluorescencji zbliża się do plateau, które jest niższe od plateau przed mitozą po jej rozpoczęciu. Technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się mitozą do zgłębienia ścisłej równowagi między cyklem, degradacją a syntezą, która reguluje przebieg mitozy.