Małoskalowe ekstrakty jądrowe do analiz funkcjonalnych aparatów ekspresji genów

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest analiza ekspresji genów przy użyciu funkcjonalnych aparatów jądrowych wyekstrahowanych z komórek. Osiąga się to poprzez wstępne zebranie i napęcznienie komórek HeLa. Następnie komórki poddaje się lizie i wirowaniu w trzecim kroku, aby uzyskać osad jąder komórkowych.

Jądra komórkowe poddawane są ekstrakcji solnej, zagęszczaniu i dializie w celu uzyskania rozpuszczalnych i funkcjonalnych aparatów ekspresji genów. Ostatecznie funkcjonalność ekstraktów jądrowych można ocenić na podstawie ich aktywności transkrypcyjnej i splicingowej, za pomocą sprzężonego systemu polimerazy RNA do transkrypcji i splicingu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak przygotowywanie masowych ekstraktów jądrowych, jest możliwość wykorzystania niewielkiej liczby komórek do przygotowania ekstraktu jądrowego.

Rozpocznij od wysiania komórek HeLa na trzech płytkach 150 mm w pożywce DMEM uzupełnionej o FBS i antybiotyki. Hoduj kultury w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2, aż komórki osiągną 90% konfluencji. W tym momencie odessaj pożywkę z kultur komórek HeLa i przemyj je raz 13 ml PBS o temperaturze pokojowej na każdą płytkę, a następnie odessaj PBS. Ustaw każdą płytkę na boku na kilka sekund i odessaj resztę PBS.

Następnie, używając skrobaka do komórek, zgarnij komórki do dolnej krawędzi każdej płytki, a następnie przenieś je do probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Na koniec odwiruj komórki w mikrowirówce przez pięć minut przy 100 ×g i w temperaturze 4 °C. Teraz odessaj PBS znad osadu komórkowego i oszacuj objętość skondensowanych komórek (PCV), obserwując skalę na probówce.

Następnie do osadu komórkowego dodać bufor hipotoniczny w objętości dwukrotności PCV. Delikatnie potrząsnąć probówką, aby resuspenderć komórki. W razie potrzeby delikatnie pipetować zawiesinę komórkową w górę i w dół za pomocą pipety 1000 µL, aby rozbić skupiska komórek.

Następnie odwirowano komórki w tych samych warunkach wirowania co poprzednio. Po wirowaniu ostrożnie odessano warstwę buforu hiptonicznego. Komórki zaczęły pęcznieć, a ich objętość zwiększyła się do około 750 do 1000 µL.

Dodać nowy bufor hipotoniczny do uzyskania końcowej objętości 1,5 milliliters i resuspender komórki w buforze. Ponownie. Na koniec inkubować resuspenderowane, obrzęknięte komórki na lodzie przez 10 minutes w celu ich schłodzenia. Przepłukać homogenizator buforem hipotonicznym, a następnie umieścić go na lodzie wraz z komórkami.

Następnie, używając delikatnej ściereczki do precyzyjnych prac, takiej jak chusteczka Kim, osusz tłuczek. Użyj wydłużonej końcówki do mikropipety 1000 µL, aby usunąć bufor z probówki. Teraz za pomocą pipety przenieś schłodzone, napęczniałe komórki do probówki.

Najtrudniejszym elementem tej procedury, kluczowym dla sukcesu, jest sprawdzenie lizy. Po każdym etapie pod mikroskopem powoli przesuń ciasno dopasowany tłuczek w górę i w dół pięć razy, aby zlizować komórki, uważając, by nie powstawały pęcherzyki powietrza. Następnie przenieś 5 µL aliquotu zawiesiny zlizowanych komórek do probówki typu Eppendorf i dodaj 10 µL błękitu trypanowego oraz 15 µL 1X PBS.

Nanieś zawiesinę komórkową na szkiełko i sprawdź pod mikroskopem świetlnym, czy doszło do lizy; jądra zlizowanych komórek przybiorą niebieski kolor po trzech uncjach. Liza jest niewystarczająca, ponieważ widoczne są liczne żywe komórki. Po pięciu uncjach stopień lizy jest odpowiedni.

Na koniec przenieś lizowane komórki do schłodzonej wcześniej probówki typu Eppendorf i odwiruj zawiesinę komórkową przez pięć minut w mikrocentryfudze przy 1500 ×g i temperaturze czterech stopni Celsius. Następnie ostrożnie przenieś nadsącz do nowej probówki, nie naruszając osadu. Teraz oszacuj objętość jąder w zawiesinie (PNV), korzystając ze skali na probówce.

Napełnić końcówkę mikropipety buforem o niskim zasoleniu w ilości odpowiadającej połowie PNV. Następnie wprowadzić końcówkę mikropipety do jąder komórkowych znajdujących się na dnie probówki typu Eppendorf. Powoli wstrzykiwać bufor do jąder, delikatnie mieszając.

Delikatnie opukaj probówkę, aby upewnić się, że osad został całkowicie resuspendowany. Następnie dodaj bufor wysokosolny w ilości odpowiadającej połowie PNV i szybko wymieszaj raz, odwracając probówkę. Inkubuj probówkę w rotatorze przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Na koniec odwiruj jądra w mikrowirówce przez 15 minut przy 18 000 ×g w temperaturze 4 °C. Rozpocznij od przeniesienia 500 µL supernatantu do schłodzonych mikrofiltrów. Odwiruj wysokosolny ekstrakt jądrowy przez 15 minut przy 14 000 ×g w temperaturze 4 °C; po wirowaniu odwróć minikoncentrator i umieść go w nowej, oddzielnej probówce EPR.

Po wirowaniu przez dwie minuty przy 1000 ×g i temperaturze 4°C, wysokosolny ekstrakt jądrowy zostanie skoncentrowany do objętości około 115 µL. Następnie przenieś 45 µL aliquoty wysokosolnego ekstraktu jądrowego do mini dializacyjnych SLI. Upewnij się, że dno slajdu styka się z dnem pływaka.

Następnie umieść SLIs w 500 mililitrach schłodzonego buforu do dializy. Na koniec mieszaj alikwoty przez jedną do dwóch godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza; po dializie ekstrakt jądrowy stanie się mętny. Ten rysunek przedstawia reprezentatywne dane porównujące sprzężoną reakcję transkrypcji polimerazy RNA dwa i splicingu w niewielkiej ilości ekstraktu jądrowego w porównaniu z ekstraktem jądrowym w skali masowej.

Kiedy konstrukt A-C-M-V-D-N-A inkubowano w ekstraktach w skali masowej lub małej, do piątej minuty po dodaniu alfa i maninu w celu zablokowania dalszej transkrypcji syntetyzowano podobne poziomy nowo powstałego pre-mRNA; produkty i półprodukty splicingu gromadziły się w czasie z podobną kinetyką w obu typach ekstraktów. Te reprezentatywne wyniki potwierdzają, że wydajność sprzężonego systemu transkrypcji polimerazą RNA II i splicingu jest podobna w ekstraktach jądrowych w skali masowej i małej. Aby zademonstrować użyteczność ekstraktu w małej skali, przygotowano ekstrakty z komórek HeLa traktowanych inhibitorem splicingu E 7 1 0 7 lub związkiem kontrolnym Platyanaly F, a następnie przeprowadzono sprzężony test transkrypcji polimerazą RNA II i splicingu, jak pokazano na tej rycinie; transkrypcja przez polimerazę RNA II zachodziła wydajnie w ekstraktach przygotowanych zarówno z komórek traktowanych Platyanaly F, jak i E 7 1 0 7.

W przeciwieństwie do tego, splicing przebiegał prawidłowo w ekstrakcie przygotowanym z komórek traktowanych analy F, lecz został zniesiony w komórkach traktowanych E 7 1 0 7. Dane te stanowią dowód koncepcji wykorzystania małoscale’owych ekstraktów jądrowych do specjalnego traktowania komórek w małej skali. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w czasie krótszym niż pięć godzin.