Bezosobnikowa tomograficzna mikroskopia na chipie z wykorzystaniem wielokątnego oświetlenia i superrozdzielczości pikselowej
16 sierpnia 2012
Bezsoczewkowa tomografia optyczna to trójwymiarowa technika mikroskopowa oferująca rozdzielczość przestrzenną <1 μm × <1 μm × <3 μm odpowiednio w wymiarach x, y i z, przy dużej objętości obrazowania wynoszącej 15-100 mm3, co może być szczególnie użyteczne w integracji z platformami typu lab-on-a-chip.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie bezsoczewkowego obrazowania trójwymiarowego preparatów biologicznych bezpośrednio na chipie w dużej objętości obrazowania. Osiąga się to poprzez umieszczenie próbki bezpośrednio na chipie sensora i zapewnienie częściowo koherentnego oświetlenia. Drugim krokiem jest przesuwanie źródła światła w różnych pozycjach poprzecznych w celu rejestracji obrazu.
Holograficzne obrazy próbki przesunięte o subpiksele. Kolejne przesunięcia subpikselowe. Obrazy holograficzne są rejestrowane przy różnych kątach oświetlenia w celu obrazowania tomograficznego.
Ostatnim etapem jest przetwarzanie danych, podczas którego pozyskany zestaw danych jest rekonstruowany cyfrowo w celu uzyskania trójwymiarowych obrazów tomograficznych próbki. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak konwencjonalna mikroskopia świetlna, jest zapewnienie wysokowydajnego obrazowania w kompaktowej architekturze. Sprawia to, że nasza platforma jest szczególnie użyteczna w integracji z platformami Lebanon chip.
W niniejszym raporcie opisano podstawową konfigurację obrazowania dla implementacji laboratoryjnej służącej do tomografii próbek statycznych. Monochromator z lampą ksenonową został dostrojony tak, aby zapewnić sygnał wyjściowy o szerokości spektralnej od około 1 do 10 nanometrów wokół długości fali centralnej od 450 do 650 nanometrów. To częściowo spójne światło jest następnie wprowadzane do wielomodowego światłowodu w celu dostarczenia częściowo spójnego promieniowania do układu.
Światłowód został zamocowany na zmotoryzowanym stole obrotowym w celu zmiany kąta oświetlenia. Zmotoryzowany stół z przymocowanym źródłem światła umieszczono na dwuwymiarowym stole liniowym XY, który służy do przesuwania źródła światła w płaszczyźnie przy danym kącie detekcji. Wykorzystano matrycę czujnika A-C-M-O-S o rozdzielczości pięciu megapikseli i rozmiarze piksela 2,2 mikrona.
Detektor służy do rejestracji holograficznych obrazów próbek o szerokim polu widzenia. Kluczowe jest, aby matryca czujnika znajdowała się w tej samej płaszczyźnie osiowej co oś obrotu źródła światła, aby upewnić się, że czujnik otrzymuje wystarczającą ilość światła przy dużych kątach oświetlenia. Chociaż bezsoczewkowa tomografia optyczna pozwala na obrazowanie różnych obiektów, takich jak komórki i mikroorganizmy, podstawowe zasady zostaną tutaj zademonstrowane poprzez wykonanie mikroskopii trójwymiarowej próbki ząbkowca morskiego z wykorzystaniem skalpela lub szpatułki.
Pobierz mały fragment AGA z szalki Petriego zawierającej hodowlę organów uszczelniających. Kawałek o kształcie sześcianu o boku kilku milimetrów będzie zawierać setki nicieni. Umieść ten mały fragment agaru w probówce polipropylenowej zawierającej jeden mililitr wody dejonizowanej.
Delikatnie mieszaj w wirówce (vortex) przez 30 sekund do jednej minuty. Po 10 do 15 minutach nicie powinny wypełznąć z agaru do wody dejonizowanej. Należy zauważyć, że nicie są tutaj zbyt małe, aby były widoczne, w celu tymczasowego unieruchomienia nicieni oraz jeden mililitr od 5 do 10 milimolarnych Lima.
Wymieszać roztwór i odczekać 10 minut. Pipetą pobrać od 5 do 10 µL próbki z dna fiolki i umieścić ją pomiędzy dwiema lamelkami. Tę próbkę, zawierającą dużą liczbę tymczasowo unieruchomionych nicieni, można umieścić na detektorze, aby rozpocząć akwizycję danych.
W celach demonstracyjnych w tej sekcji podsumowano kroki akwizycji obrazu dla typowego eksperymentu bezsoczewkowej tomografii optycznej (LOT); cały proces został jednak zautomatyzowany przy użyciu specjalnie opracowanego interfejsu LabVIEW. Aby rozpocząć kroki manualne, należy ustawić początkowy kąt obracałki na minus 50 stopni, przyjmując, że zero stopni odpowiada pionowej pozycji źródła światła. Następnie należy ustawić początkową pozycję stołu XY na 0 0, co stanowi pozycję domyślną.
Dostosuj czas ekspozycji detektora w celu optymalnego wykorzystania jego zakresu dynamicznego, tak aby obraz był jak najjaśniejszy, lecz bez nasyconych pikseli, nie zmieniając kąta nachylenia stołu obrotowego. Wykonaj dziewięć obrazów dla każdej pozycji. Przesuń stół XY do nowej pozycji w siatce kwadratowej trzy na trzy, tak aby każdy obraz był przesunięty o około jedną czwartą piksela w stosunku do poprzedniego.
Pozyskanie większej liczby obrazów pod każdym kątem może poprawić rozdzielczość, w zależności od rodzaju obiektu oraz stosunku sygnału do szumu. Po zebraniu dziewięciu obrazów pod kątem początkowym, przywróć pozycję stolika XY do punktu zero-zero. Następnie zwiększaj kąt obrotu stolika w krokach co dwa stopnie, aż do osiągnięcia wartości dodatnich 50 stopni.
Po każdym przyroście pod każdym nowym kątem powtórz opisane kroki. Przyrosty kątowe mogą być mniejsze lub większe, w zależności od optymalizacji czasu akwizycji względem rozdzielczości obrazowania. Po zakończeniu akwizycji danych uzyskuje się zestaw 459 obrazów, który zawiera dziewięć obrazów przesuniętych o subpiksele dla każdego z 51 różnych kątów oświetlenia.
Każdy zestaw dziewięciu obrazów jest przetwarzany cyfrowo przy użyciu algorytmów superrozdzielczości pikselowej w celu uzyskania jednej projekcji o wysokiej rozdzielczości. Następnie wyniki superrozdzielczości pikselowej hologramów dla każdego kąta są rekonstruowane cyfrowo, aby uzyskać 51 obrazów projekcyjnych. Przetwarzanie danych pokazano tutaj przy użyciu laptopa.
Rekonstrukcja dla pełnego pola widzenia przy użyciu jednostek przetwarzania graficznego trwałaby mniej niż jedną sekundę. Ten zestaw 51 obrazów projekcyjnych jest następnie poddawany wstecznej projekcji przy użyciu wtyczki Tom OJA. W przypadku programu Image J obrazy projekcyjne są najpierw ładowane do Image J, po czym wywoływana jest wtyczka Tom OJ.
Do OJ ładowana jest tabela wyszukiwania zawierająca kąt widzenia dla każdego obrazu projekcyjnego. Wykorzystując metodę ważonej retrospekcji (weighted back projection), można uzyskać trójwymiarowe obrazy tomograficzne próbki. Duże pole widzenia bezsoczewkowej tomografii optycznej zostało tutaj zademonstrowane poprzez umieszczenie próbki bezpośrednio na górnej powierzchni matrycy detektora. Obrazy holograficzne obiektów mogą być rejestrowane w polu widzenia o wymiarach 24 mm x 24 mm, co można dodatkowo zwiększyć, stosując nowoczesne matryce detektorów o większych obszarach aktywnych.
Chociaż rozmiar piksela macierzy detektora ogranicza rozdzielczość rejestrowanych obrazów holograficznych, techniki super-rozdzielczości pikselowej pozwalają złagodzić ten problem; przedstawione tutaj hologramy o super-rozdzielczości pikselowej wraz z zrekonstruowanymi obrazami projekcyjnymi oferują podmikrometrową rozdzielczość przestrzenną dla trzech różnych kątów oświetlenia. Obrazy projekcyjne mogą być łączone przy użyciu technik tomograficznej rekonstrukcji obrazu w celu obliczenia tomogramów preparatu. Przedstawiono tutaj trzy obrazy przekrojowe w płaszczyźnie XY przez przednią część nicienia, gdzie rurka gardłowa jest widoczna tylko w przekroju przez Z równym 8 µm, co jest zgodne z oczekiwaniami dla tej w przybliżeniu cylindrycznej struktury o zewnętrznej średnicy około 5 µm.
Ponadto obraz w przekroju w płaszczyźnie XZ wyraźnie pokazuje granice nicienia oraz znajdującą się wewnątrz rurkę przełykową, co potwierdza sukces obrazowania gardła w 3D. Wraz z dalszym rozwojem technika ta może umożliwić badaczom przeprowadzanie mikroskopii trójwymiarowej w objętościach obrazowania obejmujących rurki o długości wielu milimetrów. W związku z tym bezsoczewkowa tomografia optyczna może być użytecznym narzędziem w zastosowaniach do wysokoprzepustowego obrazowania na platformach typu lab-on-a-chip.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł omawia bezsoczewkową tomografię optyczną, trójwymiarową technikę mikroskopii umożliwiającą obrazowanie preparatów biologicznych z wysoką rozdzielczością. Metoda ta pozwala na obrazowanie dużych objętości, co czyni ją odpowiednią do integracji z platformami typu lab-on-a-chip.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Obrazowanie biologiczne
- Techniki mikroskopowe
Wstęp
- Bezsoczewkowa tomografia optyczna zapewnia rozdzielczość przestrzenną <1 μm × <1 μm × <3 μm.
- Technika ta umożliwia obrazowanie objętości od 15-100 mm³.
- Jest ona szczególnie korzystna w zastosowaniach w technologiach lab-on-a-chip.
- Metoda ta wykorzystuje oświetlenie częściowo koherentne do obrazowania.
Cel badania
- W celu uzyskania bezsoczewkowego obrazowania trójwymiarowego preparatów biologicznych.
- W celu zbadania integracji tej techniki z platformami typu lab-on-a-chip.
- W celu zwiększenia możliwości obrazowania w dużych objętościach.
Zastosowane metody
- Umieszczenie próbki bezpośrednio na chipie sensora.
- Wykorzystanie oświetlenia częściowo koherentnego.
- Lateralne przesuwanie źródła światła w celu rejestracji obrazów holograficznych przesuniętych o wartości subpikselowe.
- Rejestracja wielu obrazów holograficznych do obrazowania tomograficznego.
Główne wyniki
- Skuteczne obrazowanie preparatów biologicznych w trzech wymiarach.
- Demonstracja wysokich możliwości rozdzielczości przestrzennej.
- Efektywna integracja z platformami lab-on-a-chip.
- Walidacja metody poprzez różnorodne testy obrazowania.
Wnioski
- Bezsoczewkowa tomografia optyczna jest obiecującą techniką obrazowania biologicznego.
- Metoda ta oferuje znaczące zalety w zakresie rozdzielczości przestrzennej i objętości obrazowania.
- Przyszłe zastosowania mogą objąć różne dziedziny badań biologicznych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezsoczewkowa tomograficzna mikroskopia na chipie umożliwia wysokoprzepustowe, bezznakowe obrazowanie 3D preparatów biologicznych w dużych objętościach bez zastosowania masywnej optyki, co wspiera integrację z platformami mikrofluidycznymi i systemami lab-on-a-chip. Podejście to zmniejsza rozmiary i koszt aparatury przy zachowaniu rozdzielczości submikronowej, eliminując wąskie gardła w przepustowości próbek i kompatybilności testów na etapie odkryć. Technologia ta zwiększa pewność prognostyczną w ramach wczesnej walidacji celów, dostarczając ilościowych, rozdzielczych w głębokości danych strukturalnych do przesiewania fenotypowego i redukcji ryzyka mechanistycznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez trójwymiarową wizualizację strukturalną fenotypów komórkowych i organelli subkomórkowych.
- Wartość operacyjna: Wspiera obrazowanie żywych preparatów bez użycia znaczników, co redukuje artefakty przygotowania i pozwala zachować naturalną biologię w badaniach nad oddziaływaniem z celem molekularnym.
- Wartość prognostyczna: Generuje ilościowe dane wolumetryczne w celu wyjaśnienia mechanizmu działania oraz minimalizacji ryzyka związanego ze ścieżkami sygnałowymi celu we wczesnej fazie odkrywania leków.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia obrazowanie 3D o rozdzielczości submikronowej w szerokich polach widzenia, co umożliwia wysokoprzepustowy screening fenotypowy mikroorganizmów i populacji komórkowych.
- Wartość operacyjna: Eliminuje potrzebę stosowania soczewek i złożonej optyki, standaryzując procesy obrazowania w celu opracowania powtarzalnych i skalowalnych testów.
- Gotowość do analizy: Ułatwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do późniejszej oceny związków dzięki zautomatyzowanemu, wysokoprzepustowemu pozyskiwaniu danych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną, zapewniając spójne obrazowanie 3D w różnych systemach modelowych, takich jak *C. elegans* i embriony rybek zebrafish.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia podłużne śledzenie zmian strukturalnych w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej, co wspiera dopasowanie biomarkerów i podejmowanie decyzji o rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka.
- Wierność modelu przedklinicznego: Zachowuje natywną architekturę i dynamikę tkanek, co poprawia możliwości translacji wyników z kontekstów in vitro do in vivo.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć – od wczesnej biologii po identyfikację związków wiodących – wspierając testowanie hipotez, standaryzację testów i analitykę ilościową bez konieczności rozbudowanego przetwarzania lub znakowania próbek.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez wizualizację 3D fenotypów strukturalnych w niezakłóconych systemach biologicznych.
- Screening: Zapewnia gotowe do analizy, powtarzalne obrazowanie z wynikami ilościowymi do porównywania warunków kontrolnych i badawczych w dużych populacjach próbek.
- Analityka: Generuje tomograficzne rekonstrukcje z rozdzielczością głębokości oraz obrazy projekcyjne, które ułatwiają statystyczne porównanie cech morfologicznych.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość badań przedklinicznych poprzez obrazowanie organizmów modelowych istotnych dla danej choroby z jednolitym rozdzielczeniem i zakresem objętościowym.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonuje jako wielokrotnego użytku platforma obrazowania kompatybilna z różnymi typami próbek i formatami mikroprzepływowymi, co ogranicza nadmiarowe inwestycje w technologię.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną dzięki bezetykietowemu obrazowaniu 3D o wysokiej rozdzielczości, co redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i skalowalność dzięki konstrukcji bezsoczewkowej, zautomatyzowanemu pozyskiwaniu obrazów oraz kompatybilności z matrycami sensorów o dużym formacie.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez umożliwienie wczesnego wykrywania anomalii fenotypowych, co redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach oraz nieefektywność kapitałową.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez dostarczanie ilościowych, wieloparametrycznych danych obrazowych do obiektywnego porównywania kandydatów terapeutycznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu obrazowania obliczeniowego, holografii oraz algorytmów rekonstrukcji tomograficznej.
- Zależne od zastosowania matryc sensorów CMOS/CMOS o wysokiej rozdzielczości oraz zmotoryzowanych układów oświetlenia do przechwytywania danych pod wieloma kątami.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów oświetlenia, ustawień ekspozycji oraz procedur przesuwania subpikselowego pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Adaptacja w różnych systemach modelowych może wymagać optymalizacji metod przygotowania i immobilizacji próbek w celu utrzymania ich żywotności podczas obrazowania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wrażliwość na współczynnik załamania światła i właściwości rozpraszania próbki, co może wpływać na stosunek sygnału do szumu w przypadku preparatów gęstych lub silnie absorbujących.
