Fenotypowanie zapalne śródbłonka na chipie

Celem tego filmu jest zaprezentowanie techniki typu lab-on-a-chip do charakteryzowania stanu zapalnego komórek śródbłonka. W pierwszej kolejności ludzkie komórki śródbłonka aorty hoduje się do osiągnięcia konfluencji na podłożu do hodowli tkanek, a następnie umieszcza je w urządzeniu do wywołania naprężenia ścinającego w płytce typu Cone-and-Plate. Komórki poddaje się działaniu cytokiny prozapalnej, TNF alpha, i jednocześnie wystawia na zróżnicowane warunki naprężenia ścinającego przez cztery godziny poprzez precyzyjne kontrolowanie rotacji stożka nad podłożem; naprężenie ścinające moduluje dobrze scharakizowaną odpowiedź zapalną na cytokiny.

Obejmuje to nadekspresję cząsteczek adhezyjnych, takich jak VCAM-1 i ICAM-1. Podłoże przenosi się na stolik mikroskopu, gdzie mikrofluidyczne urządzenie PDMS jest uszczelniane próżniowo bezpośrednio do monowarstwy, co tworzy kanały przepływowe. Aktywowane komórki monocytowe THP-1 są przepuszczane nad wstępnie przygotowanymi hSEC, gdzie wiążą się proporcjonalnie do poziomu ekspresji cząsteczek adhezyjnych.

Stan zapalny śródbłonka określa się poprzez kwantyfikację całkowitej liczby trwale przytwierdzonych komórek THP one. Cześć, nazywam się she D Diverse, a ja jestem Greg Foster. I ja jestem Keith Bailey.

Znajdujemy się w laboratoriach profesorów Pastor i Simon na Wydziale Inżynierii Biomedycznej Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis. Dzisiaj przedstawimy zastosowanie podejścia opartego na systemie lab-on-a-chip do ilościowej analizy dysfunkcji i stanu zapalnego śródbłonka. Narzędzia te stanowią platformę pozwalającą na prowadzenie badań dotyczących nakładania się stresu metabolicznego na czynniki hydrodynamiczne oraz regulacji zapalnego fenotypu śródbłonka i podatności na miażdżycę.

Nasze urządzenia nazywamy naczyniowymi komorami mimetycznymi (ang. vascular mimetic microfluidic chambers) lub w skrócie VMMC. Urządzenia te pozwalają na ilościowe określenie wyników stanu zapalnego w komórkach śródbłonka i monocytach w warunkach naśladujących te panujące w naczyniach aterogennych. VMMC umożliwia wykorzystanie niewielkich ilości reagentów lub materiałów, które mogą być dostępne w ograniczonej ilości.

Mogą one być również konstruowane w wielu dostosowywalnych układach i geometriach, co czyni je bardzo odpowiednimi dla szerokiego zakresu zastosowań. Dzisiaj zaprezentujemy reprezentatywny eksperyment z wykorzystaniem naszego podejścia typu laboratorium na chipie. Ludzkie monowarstwy śródbłonka zostaną poddane aktywacji cytokinowej w warunkach ściśle zdefiniowanych naprężeń ścinających.

Zaprezentujemy zastosowanie VMC do ilościowego pomiaru rekrutacji ludzkich komórek monocytarnych do monowarstwy w czasie rzeczywistym jako funkcjonalnego wskaźnika aktywacji śródbłonka. Za pomocą tokarki z 100 milimetrowych naczyń hodowlanych wycina się okrągłe podłoża o średnicy trzech cali. Podłoża o średnicy trzech cali są płukane wodą destylowaną, a następnie sterylizowane poprzez namaczanie w 70% etanolu. Sterylne podłoża umieszcza się w 100 milimetrowych szalkach Petriego i pozostawia do wyschnięcia.

Następnie inkubuje się je z kolagenem typu I o stężeniu 100 µg/mL przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej i przemywa buforem PBS. Ludzkie komórki śródbłonka aorty (HA) są zawieszone w stężeniu 650 000 komórek/ml. Jeden mililitr zawiesiny komórkowej nanosi się w postaci kropel na wysuszone podłoże pokryte kolagenem, a następnie rozprowadza w celu uzyskania równomiernej zawiesiny.

Osadzone podłoża są następnie umieszczane w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2, aby umożliwić przywieranie do powierzchni podłoża. Po jednej godzinie dodaje się 9 mL pożywki wzrostowej EGM-2 i pozwala komórkom rosnąć w monowarstwy; monowarstwy przy około 90% konfluencji są gotowe do użycia w kolejnych eksperymentach z siłami ścinania. Naczyniowe mimetyczne komory mikroprzepływowe są konstruowane poprzez wlewanie PDMS do formy matrycowej zawierającej pożądany kształt kanału.

Bazę silikonową wlewa się do plastikowej łódki, a następnie dodaje utwardzacz silikonowy w stosunku wagowym 10:1. Żel PDMS jest następnie dokładnie wymieszany, dbając o to, aby nie zeskrobać ścianek łódki, co mogłoby wprowadzić plastikowe opiłki do mieszaniny. Matryce z fotorezystu są oczyszczane heksanem i przygotowywane do odlewu VMMC.

Następnie mieszaninę PDMS wlewa się na formę matkę, a potem umieszcza w komorze próżniowej. W komorze powietrze jest usuwane z mieszaniny PDMS i wypływa na powierzchnię po 15 minutach.

Formę wyjmuje się z komory, a następnie delikatnie przedmuchuje powierzchnię PDMS powietrzem, aby usunąć pozostałe w formie pęcherzyki powietrza. Formę należy przykryć i umieścić w piekarniku w temperaturze 37 °C na jedną godzinę, aby PDMS mógł ulec utwardzeniu. Wyjmij utwardzony żel PDMS z piekarnika i wykonaj okrężne nacięcia wokół komory za pomocą małego skalpela.

Kluczowe jest, aby przeprowadzić ten proces stopniowo, aby uniknąć kontaktu z materiałem fotorezystu, ponieważ mogłoby to uszkodzić formę matkę. Wyciąć komorę mikrofluidyczną z otworów wlotowych i wylotowych formy dla każdego kanału, używając igły Luer-Lock o rozmiarze 19 G. Dodatkowo wykonać otwory dla rurek próżniowych w miejscu oddalonym od kanałów.

Przygotowanie VMMC jest już zakończone. Do sześciu mililitrów pożywki L 15 należy pipetą dodać prozapalną cytokinę TNF alpha, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 nanograma na mililitr. Pożywka L 15 jest tutaj wykorzystywana jako płyn ścinający ze względu na jej zdolność buforowania pH w warunkach braku 5%CO2.

Następnie pożywkę pobiera się do sterylnej strzykawki o pojemności 10 ml, która służy do napełnienia urządzenia do ścinania. Konfluencyjną monowarstwę przenosi się następnie do urządzenia do ścinania komórek, które zostało wysterylizowane etanolem, wypoziomowane, a wysokość szczeliny stożka została ustawiona. Podłoże wyjmuje się z szalki Petriego, umieszcza wyśrodkowane na szklanym klocku wzorcowym i ostrożnie wprowadza do dna komory obudowy w taki sposób, aby stożek znajdował się bezpośrednio nad komórkami.

Podłoże zostaje unieruchomione poprzez równomierne dokręcenie śrub ze stali nierdzewnej wokół klocka wzorcowego. Następnie do komory wprowadza się medium ścinające, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. W kolejnym kroku za pomocą komputera wprowadza się wybrany program naprężeń ścinających i uruchamia silnik mikro-separacyjny.

W tym przypadku stosujemy oscylacyjne ścinanie z wartością zero plus lub minus 5 dyn/cm². Po czterech godzinach program ścinania zostaje zatrzymany. Klocki pomiarowe są usuwane, a podłoże zostaje ostrożnie umieszczone z powrotem w szalce Petriego.

Komórki są teraz gotowe do testu adhezji monocytów. Bezpośrednio po procesie ścinania monowarstwy HA są transportowane do stacji mikroskopowej w celu montażu VMMC. VMMC zostaje podłączony do węża próżniowego i zanurzony w wodzie DI, aby usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione w kanałach.

Przy początkowo zamkniętym zaworze próżniowym komorę ostrożnie dociska się do monowarstwy, a następnie otwiera zawór próżniowy. Kluczowe jest w tym momencie upewnienie się, że w kanałach komory nie zostały uwięzione pęcherzyki powietrza. Następnie 80 µL HBSS z wapniem i magnezem pipetuje się do zbiorniczka wykonanego z odciętej końcówki igły Luer Lock 19G; ciecz jest wypychana z końcówki poprzez mocne naciśnięcie góry zbiorniczka, który następnie wprowadza się do portu wlotowego VMMC.

Cały zestaw umieszcza się na stoliku mikroskopu, a następnie włącza kamerę mikroskopową i monitor wideo. Strzykawkę szklaną o pojemności 10 ml montuje się w pompie strzykawkowej. Następnie przewód strzykawki podłącza się do portu wylotowego VMMC.

Prędkość przepływu ustawiono tak, aby wywołać naprężenie ścinające o wartości jednej dine na centymetr kwadratowy wewnątrz kanału, a następnie uruchomiono tryb napełniania, w którym strzykawka zasysa płyn z zbiornika przez kanał. Komórki Th P one stymulowane SDF one są zawieszone w stężeniu 2 milionów komórek na mililitr. W ciągu dwóch minut od aktywacji przepływu do zbiornika dodaje się 50 µL zawiesiny komórkowej.

Ponownie, należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza po pełnym rozwinięciu przepływu. Film jest rejestrowany w częstotliwości trzech klatek na sekundę, a dane są zliczane przy użyciu oprogramowania Image J. Komórki THP-1 uznaje się za adherentne, jeśli przemieszczają się o nie więcej niż połowę średnicy komórki w ciągu 10 sekund.

Przedstawiamy tutaj dane obrazujące adhezję komórek THP-1 do monowarstw komórek śródbłonka naczyń udane pod wpływem TNF-alfa i poddane działaniu albo stałego wysokiego naprężenia ścinającego na ściankach wynoszącego 15 dyn/cm², albo oscylacyjnego naprężenia ścinającego o wartości 0 ± 5 dyn/cm². Monowarstwy poddane oscylacyjnemu naprężeniu ścinającemu wykazały trzykrotnie większą rekrutację komórek THP-1 w porównaniu z monowarstwami poddanymi wysokiemu naprężeniu ścinającemu. W niniejszej pracy demonstrujemy zastosowanie konfigurowalnych technik in vitro, które można łączyć w celu uzyskania istotnych informacji na temat wczesnych zdarzeń zapalnych leżących u podstaw miażdżycy. W szczególności ilościowo określamy skutki związane z dysfunkcją śródbłonka oraz komórkami eksponowanymi na bodźce zapalne w ściśle określonych warunkach hydrodynamicznych.

Zastosowanie VMM CS pozwala na badanie konkretnych mechanizmów leżących u podstaw oddziaływań adhezyjnych między endotelium a leukocytami. Urządzenia te charakteryzują się ponadto elastycznością i niskim kosztem, a także umożliwiają wykorzystanie materiałów o ograniczonej dostępności, takich jak komponenty pochodne surowicy od ludzi. Nasze badania z wykorzystaniem tych urządzeń obejmowały analizy stanów zapalnych indukowanych cytokinami, lipidami oraz receptorami RAGE w komórkach śródbłonka.

Opracowaliśmy również testy na chipie badające mechanizmy adhezji w wielu typach leukocytów, a także w krwi pełnej. Docelowo przewidujemy, że technologia ta umożliwi opracowanie metod ex vivo do oceny indywidualnego ryzyka wystąpienia chorób sercowo-naczyniowych pośredniczonych przez stan zapalny.