Zoptymalizowana procedura izolacji autonomicznych progenitorów neuronalnych z narządów trzewnych płodów myszy przy użyciu sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie populacji oczyszczonych progenitorów neuronalnych z zwojów obwodowego układu nerwowego. Osiąga się to poprzez wypreparowanie narządu lub konkretnych zwojów z płodów myszy. Następnie tkanki są częściowo dysocjowane, aby uwolnić poszczególne komórki do otaczającego medium.

Następnie zawiesinę komórkową filtruje się, aby usunąć wszelkie pozostałe grudki tkanki lub duże agregaty. Na koniec zawiesinę komórkową poddaje się sortowaniu przepływowemu w celu wyizolowania interesującej populacji na podstawie ekspresji fluorescencyjnego reportera w tej populacji komórek. W efekcie można porównać wzorce ekspresji genów między progenitorami, wyizolowanymi na różnych etapach rozwoju, lub między oczyszczonymi populacjami różnych typów komórek neuronalnych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z izolacją populacji komórek opartą na znakowaniu przeciwciałami jest fakt, że odczynniki immunologiczne często nie są dostępne. W takich przypadkach izolację tych populacji komórek umożliwiają genetycznie zmodyfikowane linie myszy produkujące białko fluorescencyjne w określonych podzbiorach neuronów, które znakują komórki wykazujące ekspresję konkretnego genu. Chociaż demonstrujemy tę metodę w celu izolacji progenitorów neuronalnych z jelita i szlaku neurogennego jamy ustnej, można ją zastosować również do innych systemów modelowych wykazujących ekspresję reporterów fluorescencyjnych.

Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności, ponieważ mają tendencję do zbyt długiego trawienia tkanek źródłowych, co prowadzi do utraty żywotności komórek. Przed rozpoczęciem sekcji należy obejrzeć embriony w świetle przechodzącym, aby upewnić się, że odpowiednie struktury znajdują się w ogniskowej. Następnie należy zidentyfikować embriony pozytywne pod kątem transgenu, przesiewając je pod kątem ekspresji reportera fluorescencyjnego za pomocą fluorescencyjnego stereomikroskopu.

Po uśmierceniu zarodków do naczynia sekcyjnego należy dodać minimalną ilość PBS, aby zapobiec wypływaniu zarodka na powierzchnię podczas preparacji tkanek. Rozciąć skórę zarodka wzdłuż boków ciała oraz w poprzek brzucha na poziomie wątroby. Położyć zarodek na plecach i za pomocą cienkich pęsety unieruchomić go w odpowiedniej pozycji.

Na wysokości kończyny przedniej wprowadź kolejną parę pincet na poziomie przepony, a następnie energicznie pociągnij narządy wewnętrzne w stronę ogona i z dala od grzbietowej ściany ciała, aby usunąć trzewia od wątroby aż do guzka płciowego. Jeśli jakiekolwiek organy z jamy klatki piersiowej, takie jak serce lub płuca, zostaną usunięte wraz z trzewiami, usuń je przed dalszym postępowaniem.

Po oddzieleniu trzewi brzusznych od tułowia, wprowadź pęsetę pod wątrobę, w pobliżu żołądka, i delikatnie oddziel wątrobę od jelit. Następnie ostrożnie odseparuj końcowy odcinek przewodu pokarmowego od cewki moczowej grzbietowej i usuń jelita z układu moczowo-płciowego. Na koniec odchyl jelita tak, aby śledziona była widoczna pod żołądkiem.

Usuń śledzionę i trzustkę. Rozsuń pętle jelit, trzymając za błonę krezkową. Następnie oddziel błonę krezkową i towarzyszące jej naczynia krwionośne od jelit, delikatnie pociągając za błonę krezkową.

Unikaj bezpośredniego chwytania jelita pęsetą. W przypadku przerwania jelita, należy po prostu połączyć oddzielne fragmenty na etapie dysocjacji. Połącz każdy typ tkanki w 15 mililitrowej probówce stożkowej zawierającej lodowaty HBSS, zgodnie z typem tkanki i fenotypem zarodka.

Po odwirowaniu i zebraniu osadu, z subdysekcjowanych tkanek odsysamy jak największą ilość HBSS. Następnie pellet tkankowy resuspendTime w jednej lub kilku mililitrach ACU max. Należy wymieniać końcówki pipet przed każdą próbką.

Aby uniknąć kontaminacji krzyżowej typów tkanek, umieść probówki w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na 20 do 45 minut. W zależności od etapu izolacji tkanki, dysocjacja i filtrowanie tkanki jest najtrudniejszą częścią procedury, w której należy zapobiec nadmiernej dysocjacji tkanki, a w konsekwencji niskiej żywotności komórek.

Ogranicz czas dysocjacji i nie staraj się całkowicie zdysocjować wszystkich fragmentów tkanki w połowie procesu. Po zakończeniu czasu dysocjacji manualnie rozbij tkankę, energicznie uderzając probówką o ściankę łaźni wodnej i gwałtownym ruchem nadgarstka kierując probówkę w dół. Następnie przenieś zdysocjowane próbki na lód i niezwłocznie dodaj do każdej probówki jeden mililitr świeżo przygotowanego roztworu zatrzymującego (quench), używając nowej końcówki pipety dla każdej próbki; mieszaj próbkę poprzez pipetowanie w górę i w dół, aż tkanka zostanie niemal całkowicie zdysocjowana.

Następnie, używając pęsety wysterylizowanej w etanolu, należy umieścić kwadrat o boku trzech centymetrów z membrany z nylonowej siatki o oczkach 38 mikronów nad wlotem nowej probówki stożkowej o pojemności 15 mililitrów. Następnie, używając końcówek o wąskim przekroju, należy przefiltrować roztwór poszczególnych zawiesin komórkowych przez siatkę, pipetując go w centrum membrany. Po przefiltrowaniu zawiesiny komórkowej należy przepłukać probówkę z próbką jednym mililitrem quench 1:5 i przefiltrować wszelkie pozostałe komórki.

Następnie należy usunąć membranę, uważając, aby żadne niefiltrowane próbki tkanek nie dostały się do probówki. Po odwirowaniu zawiesin komórkowych należy odessać nadsącz i resuspendować osad w 1 ml quench 1-5. Następnie każdą zawiesinę komórkową należy przefiltrować przez nylonową siatkę do probówek polistyrenowych o pojemności 5 ml, tak jak pokazano.

Zacznij od odstawienia małej porcji próbki fluorescencyjnej jako kontroli kompensacji dla samego EGFP. Następnie podziel próbkę tkanki typu dzikiego na dwie części, etykietując jedną jako typ dziki, a drugą jako seven A a d.Only. Teraz napełnij wszystkie probówki z próbkami odczynnikiem quench od jednego do pięciu, a po zcentrygowaniu próbek odessij cały nadsącz z każdej probówki, z wyjątkiem ostatnich 200 µL.

Na koniec dodaj 7-AAD do próbek przeznaczonych do sortowania oraz do kontroli z samym 7-AAD. Następnie dodaj 0,75 ml triazolu LS do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml służących do zbierania próbek. Rozpocznij od wykorzystania próbek kontrolnych do ustawienia parametrów kompensacji i bramek, aby wyeliminować martwe komórki wykazujące pozytywny sygnał 7-AAD oraz zebrać komórki wykazujące wysoką intensywność fluorescencji GFP.

Po ustawieniu parametrów kompensacji rozpocznij sortowanie przy najniższym możliwym ciśnieniu, używając dyszy o szerokim otworze i niskim przepływie. Zbierz maksymalnie 25 000 komórek do każdej probówki do mikrocentryfugi, aby nie doprowadzić do nadmiernego rozcieńczenia triol LS. Natychmiast po sortowaniu wymieszaj na wirówce (vortex) każdą probówkę z komórkami uwięzionymi w triol ls.

Na tej pierwszej rycinie przedstawiono cały preparat układu rodnego myszy w 15,5 dnia po zapłodnieniu, oglądany od strony brzusznej w oświetleniu w polu jasnym. Ta sama próbka została poddana oświetleniu fluorescencyjnemu, aby wykazać rozmieszczenie komórek pozytywnych pod kątem EGFP w nadnerczach oraz położonych przyśrodkowo zwojach trzewnych, zidentyfikowanych na podstawie ekspresji transgenu TH EGFP. Ten widok boczny podsekcjonowanego pęcherza myszy w 15,5 dniu po zapłodnieniu z transgenem TH EGFP wykazuje fluorescencję wynikającą z ekspresji transgenu w zwojach miednicznych, ścianie pęcherza oraz w cewce moczowej.

Na tym widoku grzbietowym tych samych komórek wykazujących pozytywny sygnał EGFP widoczne są tkanki przedniej części cewki moczowej na grzbiecie; dysocjacja tkanek w celu otrzymania zawiesin komórkowych do sortowania przepływowego wymaga precyzyjnej równowagi między odpowiednim trawieniem enzymatycznym a unikaniem nadmiernego trawienia, które może prowadzić do niskiej żywotności komórek. Te mikrofotografie przedstawiają tkanki dolnych dróg moczowo-płciowych oraz jelit w połowie czasu dysocjacji. Jak widać na tych zdjęciach tkanek trawionych w sposób odpowiedni przed i po manualnym rozdrobnieniu, fragmenty subdysekowanych organów są wciąż wyraźnie widoczne w tkankach poddanych działaniu enzymów zbyt długo lub przy zbyt wysokim stężeniu enzymu.

Jednakże w otrzymanej zawiesinie nie pozostają żadne duże fragmenty tkanki; odpowiednia dysocjacja i filtrowanie manualne pozwalają uzyskać profile cytometrii przepływowej, w których zazwyczaj ponad 90% komórek jest żywych, a komórki z tej populacji wykazujące ekspresję reportera zachowują wysoką intensywność ekspresji EGFP. Populacja czarna składa się z pojedynczych komórek martwych, znakowanych poprzez pochłanianie barwnika fluorescencyjnego 7-AAD. Populacja szara składa się z singletów zidentyfikowanych na podstawie rozproszenia światła w przód (forward scatter) i prostopadle (side scatter), które wykluczyły 7-AAD, a zatem są żywe.

Populacja zielona pochodzi z bramkowanego obszaru GFP-dodatniego i składa się z pojedynczych żywych komórek, które wykluczyły siedem A a d i wykazują fluorescencję EGFP. Dzięki tej procedurze można przeprowadzić izolację progenitorów neuronalnych z innych tkanek obwodowych, takich jak łańcuch współczulny, korzeń grzbietowy, zwoje lub płuca, w celu udzielenia odpowiedzi na pytania dotyczące różnic w profilach ekspresji genów między populacjami lub rozwoju odrębnych linii komórkowych.