Oczyszczanie i agregacja domeny wewnątrzkomórkowej białka prekursorowego amyloidu

Celem niniejszej procedury jest oczyszczenie wewnątrzkomórkowej domeny białka prekursorowego amyloidu, znanej również jako A ICD, oraz przedstawienie protokołu agregacji termicznej i charakterystyki A ICD przy użyciu mikroskopii sił atomowych. Jest to realizowane poprzez najpierw ekspresję białka fuzyjnego A GST z A ICD w bakteriach. Następnie białko G-S-T-A-I-C-D jest oczyszczane i cięte trombiną w celu oddzielenia GST od A ICD, po czym GST jest usuwane.

Następnie indukuje się agregację termiczną A ICD. Na koniec agregaty A ICD są obrazowane za pomocą mikroskopii sił atomowych. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące, że A ICD można oczyścić do poziomu homogeniczności w ilości wystarczającej do analiz biochemicznych i biofizycznych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, które wymagają złożonych etapów chromatografii, jest to, że wysokiej czystości i rozpuszczalna ICD można wyizolować w warunkach laboratoryjnych przy użyciu standardowych odczynników i sprzętu. ICD otrzymana zgodnie z tym protokołem nadaje się do dalszej charakterystyki biochemicznej i biofizycznej.

Procedurę zademonstruje Amina ti. Były stażysta podoktorski w moim laboratorium, dr Andres Oberer, zaprezentuje sposób wykonywania obrazowania za pomocą mikroskopii sił atomowych A ICD. Aby wyrazić rekombinowany wewnątrzkomórkowy domena A PP lub A ICD, należy rozpocząć od komórek BL 21 przekształconych wektorem pgx 41, zawierającym ludzkie A ICD połączone z końcem C GST; pojedynczą kolonią należy zaszczepić 10 mililitrów bulionu LB z ampicyliną i inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy intensywnym wytrząsaniu następnego ranka.

Inkubować 400 ml pożywki LB z ampicyliną w kolbie o pojemności jednego litra z dodatkiem 5 ml hodowli nocnej. Inkubować w temperaturze 37 °C przy intensywnym wytrząsaniu, aż gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie wartość od 0.4 do 0.6. Zazwyczaj zajmuje to od 2 do 2.5 godziny; następnie indukowć ekspresję G-S-T-A-I-C-D.

Dodajemy 0,4 mM IPTG i inkubujemy w temperaturze 37 °C przy intensywnym wstrząsaniu przez pięć godzin. Komórki wirować przy 6 000 ×g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, a osad przechowywać w temperaturze -80 °C. Po przygotowaniu buforu do lizy i schłodzeniu bakterii na lodzie, dodać do osadu 20 mL buforu i dokładnie wymieszać, łącząc wortexowanie z pipetowaniem na lodzie.

Resuspend pellet bakteryjny, a następnie przepuść resuspenderowany lizat bakteryjny przez schłodzony emulsyfikator lub prasę francuską. Przy ciśnieniu 30 000 PSI przepuść lizat przez emulsyfikator po raz drugi i zbierz go do schłodzonej probówki o pojemności 50 ml. Odwiruj lizat z prędkością 15 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 30 minut.

Oddzielić i przenieść nadsącz do schłodzonej wcześniej probówki o pojemności 50 ml. Dodać 500 µl 50% zawiesiny agarosek z glutationem. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C podczas rotacji próbki.

Po inkubacji należy przygotować świeży bufor elucyjny. Przenieść lizat i zawiesinę do jednorazowej, pięciocalowej polistyrenowej kolumny chromatograficznej z grubymi filtrami. Przemyć kolumnę pięciokrotnie, używając 3 mL PBS.

Zakryj dół kolumny i dodaj 500 µL buforu elucyjnego o temperaturze pokojowej. Zakryj górę kolumny i obracaj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zbierz wczesny eluat do schłodzonej probówki mikrocentryfugowej o pojemności 1,5 ml.

Powtórz elucję jeszcze dwa razy. Eluat dializuj przez noc w temperaturze 4 °C w czterech litrach PBS, używając membrany dializacyjnej o progu odcięcia 10 000 Da. Następnego dnia przeprowadź dializę przeciwko kolejnym czterem litrom PBS w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę.

Usunąć białko z kasety do dializy i przeprowadzić analizę ilościową białka, aby określić wydajność G-S-T-A-I-C-D. Typowa puryfikacja z 400 milliliters kultury pozwoli na uzyskanie ponad 20 milligrams oczyszczonego białka przy stężeniach od 10 do 20 milligrams per milliliter. Rozdzielić białko na aliquoty po 200 microliter i zamrozić w temperaturze minus 80 degrees Celsius.

Aby uwolnić A ICD z fuzji GST, należy wziąć 200 µL oczyszczonego G-S-T-A-I-C-D i dodać 20 µL trombiny o stężeniu 1 U/µL, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia usunąć zagregowany materiał poprzez wirowanie z prędkością 20 000 ×g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść nadsącz do schłodzonej wcześniej mikroprobówki w celu usunięcia GST i trombiny. Dodać odpowiednio 50 µL 50% zawiesiny glutationu i 50 µL 50% zawiesiny p and wino zaine.

Inkubować z rotacją przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Krótko odwirować, aby osadzić kuleczki agro, a nadsącz przenieść do nowej probówki. Przeprowadzić ekstrakcję GST jeszcze cztery razy przy użyciu glutationu.

Należy przeprowadzić oznaczanie ilości białka w 5 µL oczyszczonego A ICD. Typowe wydajności z 400 mL hodowli wynoszą od 50 do 100 µg przy stężeniu od 0,2 do 0,5 mg/mL. Po rozcieńczeniu świeżo przygotowanego A ICD w PBS do stężenia 0,1 mg/mL, indukowano agregację termiczną poprzez inkubację próbek w temperaturze 43 °C przy 800 RPM w inkubatorze z wytrząsaniem przez 48 godzin.

Rozcieńcz próbkę 20-krotnie w wodzie dejonizowanej i nanieś dwie µL na świeżo rozłupaną mikę. Próbkę susz w eksyكاته przez noc, aby zwizualizować agregaty Aβ. Do obrazowania użyj mikroskopii sił atomowych (AFM) w trybie stukowym (tapping mode) z kanti限りami z azotku cyrkonu pokrytymi złotem o nominalnym promieniu wierzchołka wynoszącym 2 nm.

Typowe amplitudy stuknięć podczas obrazowania wynoszą od 10 do 20 nanometrów przy częstotliwości rezonansowej wsporników. Przedstawiono tutaj ekspresję i względne wzbogacenie G-S-T-A-I-C-D. Po lizie większość białka fuzyjnego znajduje się w frakcji rozpuszczalnej, w związku z czym ekstrakcja z ciałek inkluzyjnych nie jest wymagana.

Materiał eluowany z kolumny z glutationem charakteryzował się czystością przekraczającą 95%. W preparacie przedstawionym w tej procedurze stężenie białka eluowanego z kolumny wynosiło 14,5 mg/ml, a wydajność wyniosła 22 mg. Inkubacja 200 µL tego preparatu przez noc z 20 jednostkami trombiny doprowadziła do niemal 100% rozszczepienia białka fuzyjnego.

Ilość użytej trombiny jest na tyle niska, że nie jest wykrywalna metodą barwienia Kumasi. Barwienie niebieskie oraz usuwanie trombiny i GST spowodowały pewną utratę materiału. Niemniej jednak czystość przekroczyła 90%, a wydajność w tej preparatyce wyniosła 70 µg A ICD przy stężeniu 0,35 mg/ml.

Agregaty ICD obrazowane za pomocą AFM są zazwyczaj amorficznymi strukturami steroidowymi o rozmiarach od 50 do 100 nanometrów. Materiał zagregowany nie jest wykrywalny, gdy do reakcji agregacji dodano ekimolarną ilość chaperony UBI Quillin one. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak oczyszczać EICD, indukować jego agregację oraz obrazować agregaty metodą AFM EICD.

Próbki oczyszczone tą techniką mogą zostać wykorzystane w innych metodach, takich jak rozpraszanie światła i testy pułapki filtracyjnej, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące wpływu chaperonów molekularnych na agregację EACD.