Heterotypowe trójwymiarowe modelowanie in vitro oddziaływań stropowo-nabłonkowych podczas inicjacji i progresji raka jajnika

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wygenerowanie trójwymiarowych modeli typowych dla wczesnych etapów rozwoju raka jajnika. W pierwszej kolejności należy stworzyć unieśmiertelnione linie komórkowe H turt pochodzące z pierwotnych, prawidłowych tkanek nabłonkowych oraz fibroblastów jajnika. Następnie, aby odtworzyć architekturę in vivo oraz złożone interakcje międzykomórkowe występujące w jajniku, należy przeprowadzić kokulturę linii komórek nabłonkowych i zrębowych w trójwymiarowych modelach sferoidów S. Następnie należy utrwalić i zabarwić kultury organoidów oraz przeanalizować ekspresję specyficznych markerów w celu zbadania cech molekularnych interakcji nabłonkowo-zrębowych.

Uzyskane wyniki pokazują, w jaki sposób zmiany w komponencie komórek zrębowych w typowych modelach 3D mogą wpływać na fenotyp współhodowanych komórek nabłonkowych. Trójwymiarowe modele typowe mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad rakiem jajnika, takie jak badanie pochodzenia tej choroby oraz wyjaśnienie roli mikrośrodowiska zrębowego w inicjacji i rozwoju nowotworu. Zastosowania tych technik, w porównaniu z innymi metodami hodowli 3D, rozszerzają się w stronę diagnostyki i terapii chorób.

Tę technikę można zastosować do szerszego zakresu objętości hodowli komórkowych i aplikacji w dalszych etapach analiz. Przykładowo, homogeniczne i typowe hodowle 3D mogą być wykorzystane do testowania leków in vitro. Podejście to można również zastosować w innych systemach modelowych, np. w badaniach nad innymi typami guzów litych lub w przypadku chorób łagodnych.

Przenieś świeżą tkankę jajnika do laboratorium hodowli komórkowych w pożywce do wzrostu unieruchomionych normalnych fibroblastów jajnika, uzupełnionej o dodatkowe antybiotyki i antymykotyki. Przemyj próbkę trzykrotnie pięcioma mililitrami PBS, aby usunąć komórki nabłonkowe, które pozostają słabo przytwierdzone do tkanki. Następnie przenieś próbkę wraz z PBS do czystej szalki hodowlanej P 100. Używając sterylnych narzędzi, przenieś tkankę do drugiej, suchej i czystej szalki hodowlanej P 100.

Pokrój tkankę na fragmenty o powierzchni 0,5 cm² i przenieś każdy z nich do oddzielnej płytki P 100. Kontynuuj krojenie tkanki na fragmenty o powierzchni mniejszej niż 1 mm². Następnie dodaj 20 ml pożywki INOF GM i inkubuj. Monitoruj wzrost komórek za pomocą mikroskopii fazowej.

Należy potwierdzić, że komórki przyległy do naczynia w ciągu 24 godzin. Wzrost komórek należy monitorować za pomocą mikroskopii fazowej. Komórki zazwyczaj przylegają do naczynia w ciągu 24 godzin. Po tygodniu należy usunąć wszelkie nieprzylegające tkanki poprzez aspirację, uzupełnić medium, a następnie dokarmiać kultury dwa razy w tygodniu przez okres od jednego do trzech tygodni, aż kolonie komórek osiągną wielkość około 500 mikronów.

Wyizolować klony za pomocą trypsyny i powlekanych dysków do klonowania. W celu potwierdzenia 100% obecności komórek fibroblastycznych, wysiać próbkę linii komórkowej na szkiełka podstawowe i przeprowadzić barwienie immunofluorescencyjne dla markera fibroblastycznego, markera nabłonkowego oraz markera komórek śródbłonka.

Na jeden dzień przed transdukcją retrowirusową przejścia H Turt, izolaty prawidłowych fibroblastów jajnika przenosi się z jednej szalki P 100 do trzech szalek P 100. Gotowy nadsącz wirusowy można zakupić lub przygotować we własnym zakresie, stosując standardowe protokoły kotransfekcji komórek HEC 2 9 3 T. Aby przygotować roztwór poly Hema, odważyć 1,5 grama poly hema i umieścić w sterylnej butelce.

Dodać 95 ml etanolu absolutnego klasy do biologii molekularnej oraz pięć ml destylowanej wody klasy do hodowli komórkowych. Umieścić roztwór poly HEMA w kąpieli wodnej w temperaturze 65 °C aż do całkowitego rozpuszczenia. Pokryć naczynia do hodowli tkanek świeżo przygotowanym roztworem poly HEMA.

Osusz naczynia hodowlane wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza. W celu zapewnienia równomiernej powłoki w przypadku większych naczyń lub kolb można zastosować delikatne kołysanie na platformie kołyszącej. Jeśli roztwór polyus wyschnie zbyt szybko, powierzchnia nie będzie gładka.

W razie potrzeby przeprowadź obróbkę wstępną fibroblastów przed hodowlą 3D; na przykład w celu indukcji starzenia komórkowego poddaj komórki działaniu subletalnych dawek nadtlenku wodoru. Odzyskaj i namnóż hodowle komórek INOF oraz komórek nabłonkowych in vitro, aby przygotować odpowiednią liczbę komórek do utworzenia heterotopowych steroidów 3D. Po pięciominutowym płukaniu w PBS dodaj 15 ml pożywki do płytki z poly hema.

W międzyczasie dodaj trypsynę do unieśmiertelnionych normalnych fibroblastów jajnika, aby odlepić je od naczynia hodowlanego. Po trzech do pięciu minutach zneutralizuj trypsynę równą objętością pożywki hodowlanej i zbierz komórki poprzez wirowanie. Resuspenduj osad komórkowy w pięciu mililitrach pożywki i dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół lub delikatnie mieszając na wstrząsarce vortex.

Następnie należy pobrać 10 µL próbki w celu wyliczenia liczby żywych komórek przy użyciu błękitu trypanowego. Teraz dodaj 4 miliony komórek INOF do pożywki wcześniej naniesionej na płytkę powlekoną poly-HEMA. Uzupełnij objętość pożywki hodowlanej do 20 mL i inkubuj w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% CO2.

Monitoruj agregację komórek w wielokomórkowe sferoidy za pomocą mikroskopii fazowej, aby dokarmiać hodowle sferoidów co dwa do trzech dni. Ustaw płytki pod kątem, opierając je o pipetę. Pozostaw sferoidy do osadzenia i ostrożnie usuń około 16 ml zużytej pożywki za pomocą pipety 5 ml.

W siódmym dniu dodaj do hodowli 16 mililitrów świeżej pożywki i przenieś ją z powrotem do inkubatora. Utwórz hodowle heterotypowe, dodając komórki nabłonkowe do fibroblastów phe. Najpierw, po policzeniu komórek, przygotuj zawiesiny komórek nabłonka jajnika za pomocą trypsyny, zgodnie z wcześniejszym opisem.

Przemyj raz w pożywce INOF GM, aby zapobiec przeniesieniu czynników wzrostu z pożywek do hodowli nabłonkowych. Po uzupełnieniu pożywki w hodowlach OID fibroblastów, dodaj komórki nabłonkowe w stosunku czterech fibroblastów na jedną komórkę nabłonkową. Heterotopowe OID w pożywce INOF GM należy dokarmiać typowo co dwa do trzech dni przez kolejne 14 dni.

W celu przeprowadzenia immunohistochemii utrwalić PHE w neutralnym buforowanym formalinie, odwirirmek PHE i zastąpić formalinę 70% etanolem. Następnie przetworzyć tkankę do parafiny, stosując standardowe protokoły wykorzystywane dla tkanek ludzkich. Steroidy zatopione w parafinie można kroić i barwić H&E lub specyficznymi markerami molekularnymi przy użyciu immunohistochemii.

Alternatywnie sterydy należy przemyć w PBS i utrwalić w 4% paraformaldehydzie. Następnie próbki należy zatopić w medium OCT i zamrozić gwałtownie w celu wykonania cięć na kriostacie oraz barwienia immunofluorescencyjnego do analizy metodą cytometrii przepływowej. Sterydy należy przemyć w PBS i dysocjować poprzez trawienie trypsyną lub Accutanem w temperaturze 37 °C.

Pełną dysocjację steroidów do postaci pojedynczej zawiesiny komórek można wspomóc poprzez pipetowanie roztworu w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml. Należy uważać, aby nie doprowadzić do nadmiernego obciążenia komórek. Reakcję należy zneutralizować równą objętością pożywki hodowlanej, a agregaty komórkowe usunąć, przepuszczając zawiesinę przez sitko komórkowe o oczkach od 40 do 70 µm. Następnie należy zcentryfugować komórki, przemyć je PBS, przeprowadzić zliczanie, a po zawieszeniu pożądanej liczby komórek w buforze fiksacyjnym, przeprowadzić barwienie zgodnie z instrukcjami producenta. W naszym laboratorium wykorzystaliśmy częściowo przekształcone komórki nabłonka jajnika i hodowaliśmy je wspólnie z normalnymi oraz starzejącymi się fibroblastami jajnika, aby naśladować wczesne stadium rozwoju raka jajnika.

W jajniku kobiety przed menopauzą barwienie immunofluorescencyjne zimmortalizowanych prawidłowych fibroblastów jajnika h hert wykazało, że zarówno pierwotne prawidłowe fibroblasty jajnika, jak i zimmortalizowane prawidłowe fibroblasty jajnika wykazują ekspresję białka specyficznego dla fibroblastów, lecz nie wykazują ekspresji cytokeratyny siedem i wykazują ekspresję vimentyny. Prawidłowe komórki fibroblastów jajnika hodowane samodzielnie w 3D w formie PHE wykazują morfologię wrzecionowatą i obfitą macierz pozakomórkową. W niniejszym doświadczeniu prawidłowe fibroblasty jajnika poddano działaniu nadtlenku wodoru w celu indukcji starzenia przez siedem dni, a następnie hodowano z częściowo transformowanymi komórkami nabłonka jajnika przez 14 dni.

Aby rozróżnić dwa typy komórek, uzyskane sferoidy poddano immunobarwieniu na Ki67 jako marker proliferacji oraz pan-cytokeratynę jako marker nabłonkowy. Ilościowa analiza danych sugeruje, że starzejące się mikrośrodowisko promuje cechy neoplastyczne częściowo przekształconych komórek nabłonkowych, podczas gdy prawidłowe mikrośrodowisko hamuje progresję neoplastyczną; przywrócone zostają cechy histologiczne komórek prawidłowych i złośliwych, których nie można wykryć podczas hodowli komórek w monowarstwie. Przykładowo, po przejściu komórek do hodowli sferoidalnej, cechy histologiczne jasnokomórkowego raka jajnika można wykryć w hodowlach 3D linii komórkowych jasnokomórkowego raka jajnika, ale nie w hodowlach monowarstwowych tych samych komórek.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przygotować trójwymiarowe kultury typiczne, służące do badania oddziaływań między komórkami nabłonkowymi a zrębowymi podczas wczesnej kancerogenezy. Podczas przygotowywania hodowli 3D ważne jest dostosowanie liczby komórek do planowanego zastosowania, z uwzględnieniem pewnych strat materiału podczas przetwarzania.

Po opanowaniu tej procedury, hodowle 3D można przygotować w ciągu jednej godziny. W celu analizy globalnych zmian w ekspresji genów, które występują w typowych hodowlach 3D, a nie są wykrywane w warunkach hodowli monowarstwowej, można zastosować inne metody, takie jak cytometria przepływowa w połączeniu z profilowaniem mikromacierzy ekspresji genów. Pozwoli to na przeanalizowanie dwukierunkowych szlaków sygnałowych występujących specyficznie w mikrośrodowisku hodowli rdzeniowej 3D.