Modele MAME do obrazowania 4D żywych komórek w celu badania oddziaływań guza z mikrośrodowiskiem wpływających na progresję złośliwą

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie trójwymiarowych modeli współhodowlanych, określanych jako inżynieria architektury i mikrośrodowiska gruczołu mlekowego (MAM), do zastosowania w obrazowaniu żywych komórek w celu obserwacji interakcji międzykomórkowych w czasie rzeczywistym. Osiąga się to poprzez uprzednie pokrycie szkiełek podstawowych kolagenem typu I w wersji DQ (fibroblast DQ quenched).

Następnie zastosowano DQ collagen.Four. Na powierzchni zestalonej macierzy DQ collagen one, czyli macierzy kolagenowej z zatopionymi fibroblastami, naniesiono zrekonstytuowaną macierz błony podstawnej. W trzecim kroku na wierzch szkiełek nakrywkowych nałożono zawiesinę komórek nabłonkowych lub nowotworowych, umożliwiając im przyczepienie się do DQ collagen, zrekonstytuowanej macierzy błony podstawnej typu four, a następnie dodano pożywkę.

W końcowej fazie wykorzystuje się mikroskopię konfokalną do obrazowania 4D, które pozwala na analizę obrazu w trzech wymiarach przestrzennych oraz w czasie dla żywych hodowli współpleszczowych mammarystycznych. Ostatecznie obrazowanie 4D umożliwia wizualizację i analizę dynamicznych interakcji pomiędzy komórkami nowotworu piersi a innymi komórkami mikrośrodowiska guza, które mogą wpływać na progresję do fenotypu inwazyjnego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie intravitalne, jest fakt, że obserwowane w naszym modelu interakcje zachodzą między komórkami jednego gatunku – ludzkimi komórkami nowotworowymi i ludzkimi komórkami towarzyszącymi nowotworowi, a nie na przykład między ludzkimi komórkami nowotworowymi a mysimi komórkami zrębu.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ przygotowanie głównych kultur rdzeniowych wymaga najpierw wizualizacji, a następnie umiarkowanych umiejętności i praktyki w celu osiągnięcia sukcesu. Należy zacząć od umieszczenia jednej wysterylizowanej alkoholem prostokątnej plastikowej pokrywy. Wsuń ją do szalki hodowlanej o średnicy 35 mm lub użyj szalki mu 35 mm marki IBI tree.

Następnie zmieszaj pożądaną liczbę fibroblastów z kolagenem DQ. Dalej, używając mikropipety 100 µL, ostrożnie nanieś i rozprowadź 70 µL mieszaniny fibroblastów z kolagenem DQ (jedna macierz kolagenowa) na całej powierzchni szkiełka podstawowego, a następnie umieść szalkę hodowlaną w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C bez dwutlenku węgla na 30 minut. Po zestaleniu się macierzy pozostaw je do równowagi na 10 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2.

Następnie umieść płytkę pod dygestorium, aż osiągnie temperaturę pokojową. Na powierzchnię zestalonego kolagenu DQ nanieś 60 µL zrekonstytuowanej macierzy błony podstawnej DQ collagen four, a następnie macierz collagen one z zatopionymi fibroblastami. Następnie, używając końcówki pipety, ostrożnie i równomiernie rozprowadź zrekonstytuowaną macierz błony podstawnej DQ collagen four, unikając uszkodzenia macierzy fibroblastów DQ collagen one, collagen one matrix.

Następnie przenieś szalkę i szkiełko podstawowe do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5% carbon dioxide na 10 minut, aby umożliwić zestalenie się macierzy błony podstawnej DQ collagen four. Przetraw trypsyną oczy i policz komórki do kokultury. Teraz nanieś 50 µL zawiesiny komórkowej na powlekane szkiełko podstawowe i umieść szalkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% carbon dioxide na 40 do 60 minut, aby komórki mogły przytwierdzić się do macierzy błony podstawnej DQ collagen four. Po przytwierdzeniu się komórek do macierzy, dodaj 2 mL pożywki hodowlanej zawierającej 2% zrekonstytuowaną błonę podstawną do szalki 35 mm.

Następnie inkubować przez pożądany czas przed obrazowaniem; po przemyciu buforem PBS inkubować kokultury z 5 µM cell tracker orange w medium MEGM w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 45 minut. Po inkubacji ponownie przemyć kokultury buforem PBS i inkubować je w podgrzanym medium MEGM przez 30 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Wykonać obrazowanie żywych kokultur przy niskim powiększeniu, na przykład 10x, przy użyciu obiektywu imersyjnego w wodzie na mikroskopie konfokalnym, rejestrując przekroje optyczne w odstępach 10 µm przez całą głębokość struktur.

Wykorzystaj przekroje optyczne do rekonstrukcji obrazów w 3D przy użyciu oprogramowania Velocity lub podobnego programu. Przygotuj filmy z rekonstrukcji 3D, aby umożliwić wizualizację struktur, interakcji międzykomórkowych oraz oddziaływań z otaczającą macierzą. Na tym reprezentatywnym schemacie ko-kultury, naczynie IBI treat mu zostało najpierw pokryte kolagenem, jedno zawierało kolagen DQ, a drugie fibroblasty, widoczne tutaj na kolor magenta.

Następnie dodano drugą warstwę zrekonstruowanej błony podstawnej zawierającą kolagen IV DQ. W dalszej kolejności na wierzchu wysiano komórki nowotworowe (zaznaczone na czerwono) w 2% zrekonstruowanej błonie podstawnej. W hodowli.

Media reprezentowane przez kremowe kropki były nakładane przy każdej zmianie pożywki. Fluorescencyjne produkty rozkładu DQ collagen one i four są przedstawione w kolorze zielonym. W ciągu 23 dni tej reprezentatywnej kokultury MCF 10 DCIS i WS 12 TI zaobserwowano proliferację komórek przedstawionych tutaj oraz na kolejnych rysunkach (kolor czerwony), a także degradację DQ collagen four i one widoczną tutaj i na kolejnych rysunkach (kolor zielony) oraz macierzy kolagenowych, co wskazuje redukcja objętości kokultur.

Te same żywe kokultury obserwowano przez 23 dni, wykonując obrazy za pomocą mikroskopii konfokalnej w trzecim, szesnastym i dwudziestym trzecim dniu kokultury. Interakcje w kokulturach Mame są dynamiczne i mogą zmieniać się w czasie. Na przykład, jak widać na tym modelu 3D kokultury komórek mam z trzeciego dnia, w tym momencie komórki dopiero zaczynają proliferować w macierzach, pozostając wciąż dość stabilne, co potwierdza brak zielonej fluorescencji.

Jednak do 16. dnia, w miarę dalszej proliferacji komórek, zaczęły one również degradować strukturę macierzy, co obserwujemy tutaj dzięki produktom rozszczepienia kolagenu DQ typu 1 i 4 w kolorze zielonym oraz aktywnemu rozkładowi macierzy przez komórki, gdzie macierz i komórki wykazują współfluorescencję widoczną w kolorze żółtym. Do 23. dnia prawie połowa macierzy została zdegradowana przez szybko proliferujące komórki w porównaniu do trzeciego dnia, kiedy objętość kokultury wynosiła 110 000 µm³. Między 16. a 23. dniem objętość została zredukowana do zaledwie 46 250 µm³ w tym dniu.

W co-kulturze 16 można zaobserwować proteolizę kolagenu DQ cztery na powierzchni komórek DCIS zaznaczonych na czerwono oraz rozproszoną proteolizę kolagenu DQ jeden w obszarach sąsiadujących z fibroblastami zaznaczonymi na biało. Zróżnicowane barwienie zastosowane w tej ko-kulturze pozwala również na obserwację odrębnych wzorców migracji i proliferacji dwóch typów komórek po ich rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie raka piersi do zgłębiania wpływu makrośrodowiska guza na progresję nowotworu, umożliwiając obrazowanie żywych komórek i dynamicznych interakcji między komórkami rakowymi a otaczającymi je komórkami zrębu.