Podejście z zastosowaniem równoległego przetwarzania wielu celów w wyznaczaniu struktury na podstawie sekwencji genu podjednostki PB2 polimerazy wirusa grypy

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest zastosowanie podejścia wielocelowego do ustrukturyzowanego wyznaczania struktury białka docelowego metodą krystalografii rentgenowskiej, zaczynając od pojedynczego genu lub sekwencji genetycznej, jak w przedstawionym tutaj przypadku. Białkiem docelowym jest podjednostka polimerazy PB2 wirusa grypy A, będąca kluczowym elementem replikacji wirusa. Podejście wielocelowe realizowane jest poprzez równoległe zaprojektowanie i sklonowanie serii konstruktów genetycznych w oparciu o pojedynczą sekwencję docelową oraz inne znane informacje na temat białka.

Drugim krokiem jest przetestowanie poziomów ekspresji dla każdego konstruktu i wybór najlepszych z nich do wielkoskalowej ekspresji białek w hodowli komórkowej. Kolejny etap wymaga rozbicia komórek w celu wyodrębnienia białek docelowych z materiału ekspresyjnego i oczyszczenia każdego z nich do bardzo wysokiego stopnia czystości. Następnie dla każdego białka przeprowadza się serię prób krystalizacji, aby uzyskać formę kryształu odpowiednią do badań rentgenowskich.

Następnie gromadzone są dane z dyfrakcji rentgenowskiej o wysokiej rozdzielczości dla jednego lub więcej kryształów, które służą do rozwiązania i udoskonalenia mapy gęstości elektronowej określającej strukturę każdego białka docelowego. Wyniki te umożliwiają stworzenie trójwymiarowej struktury białka docelowego na podstawie mapy gęstości elektronowej. Przetwarzanie wielu celów jednocześnie znacznie zwiększa prawdopodobieństwo sukcesu w określaniu struktury, zapewniając dostępne alternatywy na każdym potencjalnym etapie utrudniającym przebieg procesu.

Równoległa analiza wielu celów jest również wysoce efektywna, co pozwala zredukować czas i koszt uzyskania każdego białka na każdym etapie. Potencjał zwiększenia tempa wyznaczania struktur dla celów terapeutycznych umożliwi stworzenie większej liczby możliwości rozwoju terapii w ciągu roku. Chociaż metoda ta może dostarczyć cennych informacji w biologii strukturalnej, wysokiej jakości białka otrzymane tymi sposobami mogą wesprzeć wszelkie badania oparte na białkach.

Każda faza tego procesu opiera się na odrębnych podstawach naukowych i wymaga specjalistycznej wiedzy, jednak inwestycja w kadrę, instrumentarium i know-how może przynieść doskonałe rezultaty po zintegrowaniu wszystkich elementów. Po wybraniu do badań genu docelowego oraz produktu genu, pierwszym krokiem jest zaprojektowanie wielu wariantów genetycznych lub konstruktów. Do projektowania tych konstruktów na poziomie białka, wraz z powiązanym kodem w inżynieryjnych syntetycznych sekwencjach genów, wykorzystuje się oprogramowanie typu gene composer.

Używając modułu przeglądarki dopasowań (alignment viewer) oraz modułu projektowania konstruktów, porównaj dopasowania sekwencji białkowych i zdefiniuj primery terminalne lub amplikony dla PCR insertu i PCR wektora w projekcie konstruktów białkowych. Następnie wykorzystaj algorytm konwersji białka na DNA w programie Gene Composer, aby przeprowadzić odwrotną translację każdej sekwencji aminokwasowej na odpowiednią zmodyfikowaną sekwencję nukleotydową. Skorzystaj z właściwej tabeli stosowania kodonów, aby zoptymalizować sekwencję pod kątem ekspresji w konkretnej linii komórkowej.

W tym przypadku zastosowano bakterie E. coli. Po przygotowaniu sekwencji genu docelowego należy dokonać wirtualnego klonowania i wprowadzić gen do odpowiedniego plazmidu wektora do ekspresji bakteryjnej. W tym przypadku wykorzystano zmodyfikowany wektor pET 28.

Wektor ten zawiera określone komponenty niezbędne do ekspresji i oczyszczania białek. Gen docelowy zostaje zmodyfikowany w celu wprowadzenia sekwencji znacznika histydynowego na końcu N- lub C-białka oraz sekwencji cięcia, aby umożliwić usunięcie znacznika podczas oczyszczania. Wektor posiada również gen oporności na antybiotyki, służący do testowania ekspresji i fermentacji.

Następnie każda sekwencja genetyczna białka docelowego jest tworzona standardowymi metodami syntezy genów w przygotowaniu do metody PIPE cloning (polymerase incomplete primary extension cloning). PIPE cloning to strategia klonowania oparta na PCR, w której gen docelowy jest amplifikowany za pomocą starterów komplementarnych do zamierzonego wektora. Metoda ta wykorzystuje niepełny charakter końcowego etapu PCR, co sprawia, że produkty PCR posiadają zmienne jednoniciowe końce. Przygotowuję PCR wkładu (insert PCR lub IPCR), dodając po 5 µL starterów forward i reverse do każdej reakcji.

Do płytki 96-dołkowej, zgodnie z mapą płytki, nanieś 2 µL każdego pełnego syntetycznego genu do odpowiedniego dołka. Po dodaniu 25 µL master mixu PFU do każdego dołka, przeprowadź 25 cykli reakcji, stosując następujące warunki PCR. Denaturacja w 95 °C przez 30 sekund.

Wygrzewać w temperaturze 50 °C przez 45 sekund, a następnie przedłużyć w temperaturze 68 °C przez trzy minuty. Amplifikację fragmentów potwierdza analiza produktów IPCR na żelu AGROS. Pomyślnie uzyskane produkty IPCR objawiają się w postaci wyraźnych prążków.

Mniej pożądane wyniki często objawiają się jako słabe lub rozmazane prążki w oddzielnej reakcji. Plazmid ekspresyjny jest powielany za pomocą wektorowej PCR (VPCR) lub potwierdza się amplifikację fragmentu VPCR poprzez analizę żelową AROS produktów VPCR. Po amplifikacji produktów IPCR i VPCR są one dodawane na płytkę do łączenia i umieszczane w termocyklerze w celu przeprowadzenia reakcji łączenia.

Pomyślnie sklonowane konstrukty są następnie transformowane do chemicznie kompetentnych komórek e coli i przechowywane w stokach glicerolowych w celu rozpoczęcia testów ekspresji metodą posiewu. Niewielką ilość każdej próbki ze stoku glicerolowego sklonowanego konstruktu nanosi się na osobną płytkę agarową. Płytka jest przygotowana z pożywki bakteryjnej i markera antybiotykowego Kanamycyną zakodowanego w wektorze, a następnie inkubowana przez noc w temperaturze 37 °C.

Rozpocznij przygotowanie prekultury dla każdej próbki, pobierając pojedynczą kolonię z nowo wyhodowanej płytki agarowej. Wykorzystaj tę kolonię do inokulacji 1,2 milliliters bulionu TB uzupełnionego o kanamycynę i glukozę w celu równoległego przetwarzania. Każda prekultura jest hodowana w 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem.

Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 220 obr./min. Po nocnej inkubacji przygotować małoscale kultury indukcyjne dla każdej próbki, wykorzystując 40 µL prekultury do inokulacji.

1,2 ml pożywki TB. Uzupełnione o 50 mg/ml kanamycyny oraz system NovaGen Overnight Express. 1. Hodować kultury indukcyjne w temperaturze 20 °C przez 48 godzin, wstrząsając przy 220 RPM. Zebrać komórki poprzez wirowanie przy 4 000 ×g przez 15 minut.

Odlej nadsącz i przechowuj osady w temperaturze -20 °C przez co najmniej jedną godzinę przed dalszą obróbką po oczyszczaniu. Przeanalizuj białko z reakcją rozszczepienia i bez niej za pomocą elektroforezy kapilarnej, wykorzystując system Caliper Lab CHIP 90 zgodnie z protokołem producenta. W przypadku białka PB2 wirusa grypy A, 14 z 34 konstruktów podjednostek doprowadziło do uzyskania rozpuszczalnego białka docelowego, które przeszło do następnego etapu, czyli fermentacji na dużą skalę.

Aby rozpocząć fermentację na dużą skalę, zaszczepić 100 mililitrów pożywki z kulturą komórek bakteryjnych zawierającej 50 mg/mL kanamycyny z zapasu w glicerolu i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 220 RPM. Następnego dnia rozszerzyć prekulturę, wykorzystując 10 mililitrów do zaszczepienia.

Jeden litr pożywki zawierającej medium autoindukcyjne oraz 50 mg/mL kanamycyny w dwulitrowej kolbie z przegrodami. Inkubować hodowle w wytrząsaniu w temperaturze 37 °C, z wytrząsaniem w przybliżeniu co 30 minut. Sprawdzić gęstość optyczną hodowli, mierząc absorbancję UV przy długości fali 600 nm.

Po osiągnięciu gęstości optycznej 0.6, po pożądanym czasie wzrostu, zmień temperaturę w inkubatorze z wytrząsaniem na 20 °C. Pobierz reprezentatywną alikwot 10 mL z każdego konstruktu w celu przetestowania ekspresji. Zbierz komórki poprzez wirowanie przy 5 000 ×g przez 15 minut.

Odlać nadsącz i zamrozić osad komórkowy w temperaturze -80 °C. Aby rozpocząć tę procedurę, rozmrozić i resuspender pastę komórkową w buforze lizującym w stosunku objętości 1:5. Intensywnie mieszać przez 30 minut w temperaturze 4 °C.

Używając czystej szpatułki, oddziel grudki przyklejone do ścianek zlewki. Przeprowadź mechaniczną lizę komórek w lodzie za pomocą sonikatora. Klaruj surowy lizat poprzez wirowanie przy 18 000 GForce przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zebrać nadsącz i zachować niewielką alikwot do analizy przed przystąpieniem do puryfikacji na dużą skalę. Potwierdzić ekspresję białka na dużą skalę dla każdej hodowli za pomocą analizy żelu SDS-PAGE. Ten reprezentatywny wynik SDS-PAGE wykazuje silną ekspresję białka, około 50% rozpuszczalności i około 50% cięcia.

W tym przypadku usunięto znacznik histydynowy wraz z dodanym znacznikiem rozpuszczalności białka, który został wprowadzony do oryginalnego konstruktu. Żywica niklowa służy do oddzielenia białka docelowego z unikalnym znacznikiem histydynowym od pozostałego materiału komórkowego, w tym natywnych białek bakteryjnych. Kolumnę niklową przygotowuje się poprzez przemycie czterema objętościami kolumny wody DEPC w celu usunięcia buforu do przechowywania, a następnie jedną objętością kolumny buforu B oraz pięcioma objętościami kolumny buforu.

Równoległe przeprowadzanie równoważenia A do E wykonuje się za pomocą urządzenia do oczyszczania białek, które umożliwia jednoczesną pracę na wielu kolumnach. Każdy oczyszczony lizat zawierający solubilizowane białko z tagiem histydynowym należy nałożyć na osobną kolumnę z szybkością 2 mL/min, a następnie przemyć kolumnę kilkukrotnością jej objętości buforem A, zbierając i zachowując do analizy frakcję przepływową. Białko związane z żywicą eluje się w serii gradientów skokowych buforami A i B w proporcjach 95:5, 60:40 i na koniec 100% buforu B. Składniki buforu B konkurują z histydyną o miejsca wiązania na żywicy niklowej, usuwając w ten sposób białko z kolumny przy określonym stosunku stężeń.

Każdą frakcję elucyjną należy zbierać oddzielnie. Przedstawiony jest tutaj reprezentatywny chromatogram z przebiegu na kolumnie niklowej. Frakcje elucyjne z kolumny niklowej, lizat surowy, lizat oczyszczony oraz przepływ z kolumny niklowej należy przeanalizować za pomocą elektroforezy SDS-PAGE i porównać z absorbancją UV przy 280 nm zarejestrowaną podczas oczyszczania na kolumnie.

Ten etap pozwala określić, czy oczyszczanie zakończyło się sukcesem. Należy wybrać i połączyć frakcje zawierające docelowe białko w celu ich dalszego przetwarzania. Oblicz całkowitą ilość białka na tym etapie, wykorzystując teoretyczny współczynnik ekstynkcji białka, mierząc absorbancję UV przy 280 nanometrach i uwzględniając całkowitą objętość połączonych frakcji.

Zachowaj niewielką próbkę do analizy. Gen białka docelowego zakodowano ze specyficzną sekwencją, która jest rozpoznawana przez ULP1 jako miejsce cięcia, zatem dodanie ULP1 prowadzi do rozszczepienia wiązania między znacznikiem histydynowym a białkiem docelowym. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj 1 µL proteazy podobnej do ubikwityny 1 na każde 5 mg białka obecnego w połączonych frakcjach.

Na tym etapie odszczepione białko przenosi się z buforu B do buforu A w celu dalszej obróbki za pomocą tubingu dializacyjnego; białko dializuje się przeciwko dwóm litrom buforu A przez cztery godziny w temperaturze czterech stopni Celsius z mieszaniem. W przypadku PB two po dializie należy zastosować próg odcięcia masy cząsteczkowej 10 kilodalton. Następnie wykonuje się kolejną elektroforezę w żelu SDS-PAGE białka docelowego z obecnością i bez obecności ULP one.

Pozwoli to określić, czy cięcie przez ULP1 przebiegło pomyślnie i umożliwi wybór najlepszych frakcji do dalszej obróbki. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki elektroforezy SDS-PAGE dla trzech konstruktów polimerazy pb. Markery masy cząsteczkowej dwóch podjednostek znajdują się w pierwszej ścieżce.

Ścieżki 2, 6 i 10 zawierają połączone białka z kolumn niklowych nr 1. Ścieżki 3, 7 i 11 zawierają przedział przepływowy odszczepionego białka w buforze A z kolumn niklowych nr 2, a ścieżki 4, 8 i 12 wykazują usunięcie znacznika histydynowego w buforze B z kolumn niklowych nr 2.

Po usunięciu histaminy połączone frakcje z kolumny niklowej są zagęszczane. Aby rozpocząć SEC, należy ponownie dobrać odpowiednią żywicę na podstawie masy cząsteczkowej białka docelowego. W tym przypadku zastosowano kolumnę acere S 110 over 30 GL, którą wyrównano przy użyciu 200 mililitrów buforu SEC przy szybkości przepływu 0,5 mililitra na minutę. Za pomocą strzykawki o objętości pięciu mililitrów naniesiono próbkę do pętli próbnej o objętości 10 mililitrów i rozpoczęto rozdział na kolumnie SEC. Monitorowano chromatogram absorbancji UV przy 280 nanometrach, zbierając frakcje o małej objętości.

Przeanalizuj wszystkie odpowiednie frakcje SEC za pomocą elektroforezy SDS-PAGE. Standardowe podejście do prób krystalizacji białek przeprowadza się metodą siedzących kropel z wykorzystaniem dyfuzji pary. Często na samym początku dla każdego białka docelowego przygotowuje się dwie lub więcej ekranów rzadkiej macierzy (sparse matrix screens).

Aby rozpocząć ten proces, należy napełnić każdy rezerwuar 96-dołkowej kompaktowej płyty krystalizacyjnej typu junior 80 µL każdego warunku z wybranego ekranu krystalizacyjnego. Do każdego z 96 dołków należy odmierzyć 0,4 µL białka w buforze SEC. Następnie należy dodać 0,4 µL roztworu z ekranu krystalizacyjnego, zapewniając całkowite wymieszanie kropli w każdym dołku. Całą płytę należy przykryć przezroczystą taśmą uszczelniającą, zapewniając pełną szczelność każdego dołka. Płytę należy przechowywać w temperaturze 16 °C w miejscu niezakłóconym, wolnym od wibracji środowiskowych.

W ciągu najbliższych kilku tygodni okresowo sprawdzaj pod mikroskopem stereoskopowym, czy doszło do krystalizacji białka. Jeśli kryształy białka się nie pojawią, przygotuj nowe płytki z innymi warunkami i zmień stężenie białka w końcowej kropli, aby zwiększyć szansę na sukces przed etapem zbioru. Aby rozpocząć zbiór, schłodź dysk typu ALS w naczyniu wypełnionym ciekłym azotem i przykryj go pokrywką.

Odetnij przezroczystą taśmę zakrywającą dołek z kryształem białka docelowego i przenieś go do pobliskiego pustego dołka. Dodaj 1,6 µl odpowiedniego warunku krystalizacji i połącz z 0,4 µl glikolu etylenowego. Roztwór 20% glikolu etylenowego w warunku krystalizacji chroni kryształ białka.

Podczas mrożenia kriogenicznego przeanalizuj kryształ pod mikroskopem i wybierz odpowiednią pętlę kriogeniczną do zbioru, dopasowując jej średnicę wewnętrzną do maksymalnej szerokości kryształu. Zamocuj pętlę kriogeniczną do magnetycznego uchwytu do kryształów i wyłów kryształ bezpośrednio z roztworu w studzience. Natychmiast zanurz pętlę kriogeniczną z zebranym kryształem w krioprotektorze, a następnie umieść go w kasecie typu LS.

Aby szybko zamrozić kryształy, zamroź powtórzenia dla pożądanej liczby kryształów. Po zakończeniu zbioru użyj pręta do pucków, aby umieścić magnetyczną pokrywkę na pucku zawierającym szybko zamrożone kryształy z wygiętymi językami. Odwróć puck do góry dnem na potrzeby następnego kroku.

Przykręć wypychacz do pucka, następnie przenieś puck do urządzenia KU actor doer i użyj go do zbicia pokrywki. Kryształy w pucku pozostają zamrożone w kąpieli z ciekłego azotu do momentu rozpoczęcia badań dyfrakcji rentgenowskiej przy użyciu oprogramowania do akwizycji obrazów J Director. Ustaw następujące parametry dla screeningu kryształów: szczelinę wiązki na 0,5 stopnia, odległość detektora 50 mm, krok obrazu 70 stopni oraz czas ekspozycji 30 sekund.

Poniżej znajduje się przykładowy zrzut ekranu z oprogramowania do akwizycji obrazów podczas przesiewania kryształów; panel centralny przedstawia obserwowaną dyfrakcję promieni rentgenowskich z reprezentatywnego kryształu, z którego zebrano wystarczającą liczbę obrazów o wysokiej rozdzielczości dla pełnego zestawu danych niezbędnego do wyznaczenia struktury trójwymiarowej. Strategie klonowania i oczyszczania białek przedstawione w tym filmie pozwoliły na uzyskanie 14 oczyszczonych próbek PB two, z których dziewięć dało kryształy odpowiednie do badań dyfrakcyjnych. Wewnętrzny zestaw danych dyfrakcji promieni rentgenowskich został zebrany dla pięciu z dziewięciu konstruktów z wykorzystaniem promieniowania QK alpha, przy użyciu generatora promieni rentgenowskich z rotującą anodą Rigaku Super Bright FRE Plus, wyposażonego w optykę Ossec Variax HF oraz detektor CCD Saturn 944 Plus.

Tutaj przedstawiono obraz dyfrakcji rentgenowskiej podjednostki PB2 polimerazy. Każdy zestaw danych został przetworzony, w wyniku czego wyznaczono łącznie cztery struktury podjednostki PB2. Każda struktura została poddana recenzji i przesłana do banku danych białek (Protein Data Bank) w celu zapewnienia publicznego dostępu.

Rysunek ten przedstawia diagramy wstęgkowe cząsteczek w asymetrycznej jednostce krystalograficznej. W przypadku czterech struktur PB2, struktury drugorzędowe są pokolorowane w schemacie tęczy wraz z odpowiadającymi im kodami PDB. W poniższej tabeli przedstawiono analizę wyników dla celów PB2 wirusa grypy, wykonaną metodami opisanymi w tym artykule wideo.

Wielocelowy potok równoległego przetwarzania w celu wyznaczania struktury genu został przedstawiony w pięciu etapach: klonowania, badania rozpuszczalności, oczyszczania, krystalizacji oraz wyznaczania struktury. Wynik działania naszego potoku biologii strukturalnej nie tylko stanowi podstawę dla badań strukturalnych, ale także zasila dodatkowe analizy, takie jak testy funkcjonalne w celu potwierdzenia funkcji białka lub przesiewy biofizyczne nowych związków za pomocą MAR lub SPR w celu zidentyfikowania nowych punktów wyjścia dla opracowywania leków. Technika ta oraz stworzone wraz z nią narzędzia pomogły utorować drogę biologom strukturalnym do prowadzenia wielu rodzajów badań opartych na odkryciach, w tym projektowania leków w oparciu o strukturę, co miało ogromny wpływ na zdrowie ludzi i walkę z chorobami.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, w jaki sposób równoległe przetwarzanie wielu celów może znacznie zwiększyć sukces w wyznaczaniu struktur. Należy pamiętać, że praca w laboratorium biologii strukturalnej może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania czynności laboratoryjnych zawsze należy przestrzegać odpowiednich środków ostrożności, takich jak stosowanie środków ochrony osobistej (PPE).