Monitorowanie komórkowych autonomicznych rytmów okołodobowych ekspresji genów z wykorzystaniem reporterów bioluminescencyjnych lucyferazy

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje proces tworzenia linii komórkowych z reporterem lucyferazy oraz późniejsze monitorowanie autonomicznych rytmów okołodobowych ekspresji bioluminescencji w komórkach. W pierwszej kolejności należy skonstruować lentiwirusowe reportery ekspresji lucyferazy i wytworzyć cząstki lentiwirusowe, a następnie zainfekować docelowe komórki i namnożyć wybrane kultury. Następnie monitoruje się ekspresję bioluminescencji w zsynchronizowanych komórkach reporterowych przy użyciu odpowiedniego urządzenia rejestrującego.

Ostatecznie rejestracja bioluminescencji jest wykorzystywana do wykazania komórkowych autonomicznych rytmów okołodobowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak transfekcja przejściowa i ochrona linii zarodkowej, jest fakt, że VIR pośredniczy w stabilnej integracji genu z genomem komórek, zapewniając tym samym większą wydajność i wszechstronność.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu badań nad zegarem okołodobowym. Na przykład: czy istnieją tkankowo specyficzne zegary okołodobowe? Jeśli tak, jakie są właściwości tkankowo specyficznych zegarów okołodobowych?

Choć ta metoda może dostarczyć informacji na temat mechanizmów zegarowych, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak dynamika cyklu komórkowego, tumorigenza i tym podobne. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas w momencie, gdy zdecydowaliśmy się badać zegary epigenetyczne specyficzne dla tkanek lub typów komórek.

Procedurę zaprezentują dr Chita Norm Napkin, pracownik postdoktorski, oraz Sandra, studentka studiów doktoranckich z mojego laboratorium Atory. Zazwyczaj ssaczy konstrukt raportujący rytm dobowy zawiera kasetę ekspresyjną, w której promotor okołodobowy jest połączony z genem lucyferazy. W tym lentiwirusowym raporcie zdestabilizowana lucyferaza znajduje się pod kontrolą promotoru mysiego genu per2.

W celu uzyskania szczegółowych instrukcji dotyczących konstruowania wektorów reporterowych za pomocą reakcji rekombinacji, należy zapoznać się z towarzyszącym rękopisem dotyczącym wydajnej transfekcji. Należy rozpocząć od hodowli ludzkich komórek embrionalnej nerki o niskiej liczbie pasażów, które osiągnęły 90 do 100% konfluencji. Następnie należy pokryć warstwą komórek sześciodołkowe płytki hodowlane.

W celu przeprowadzenia transfekcji do każdego dołka należy dodać jeden mililitr 0,001% poly L lycine, inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut i wypłukać raz buforem PBS. Następnie należy zebrać komórki za pomocą trypsyny i wysiać je do każdego dołka uprzednio powleczonych płytek. Płytki należy delikatnie zakręcić, aby uzyskać równomierny rozkład komórek.

Należy sprawdzić, czy zasiane komórki osiągnęły stopień konfluencji od 80 do 90% w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Przygotować mieszaninę do transfekcji plazmidowej składającą się z plazmidu reporterowego lentiwirusowego, DNA oraz trzech wektorów pakujących, służących jako kontrola zarówno dla transfekcji, jak i późniejszej infekcji. Należy uwzględnić dodatkową studzienkę dla lentiwirusowego wektora ekspresyjnego GFP, który zawiera ulepszone zielone białko fluorescencyjne pod kontrolą promotora CMV.

Następnie do plazmidów należy dodać 100 µL 0,25 M chlorku wapnia i dokładnie wymieszać. Potem dodaje się 100 µL roztworu 2x XBBS i miesza delikatnie, lecz dokładnie. Mieszaninę DNA inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

W czasie oczekiwania wymień pożywkę w komórkach 2 9 3 T na dwa mililitry świeżej pożywki. Włóż płytkę z powrotem do inkubatora na co najmniej 10 minut, aby zrównoważyć pH pożywki. Następnie, dodając kroplami, dodaj mieszaninę do transfekcji do komórek, delikatnie zakręć płytką, zaobserwuj tworzenie się cząsteczek pod mikroskopem, a następnie umieść komórki w inkubatorze na noc.

Około 16 godzin po transfekcji uzupełnij medium, dodając dwa mililitry świeżego DMEM, i inkubuj przez noc. Następnie, aby ocenić wydajność transfekcji, sprawdź ekspresję EGFP w komórkach kontrolnych poddanych transfekcji. Wydajność transfekcji na poziomie od 90 do 100% z wysoką ekspresją EGFP jest wiarygodnym wskaźnikiem dobrej jakości preparatu wirusowego.

Zebrać pożywkę zawierającą wydzielone zakaźne cząsteczki wirusa i odwirować ją w celu usunięcia pozostałych komórek 2 9 3 T, a następnie zebrać supernatant zawierający wirusa. W trzecim dniu wysiać około 12 003 komórek T three na płytkę 12-dołkową, inkubować przez noc do uzyskania 20 do 30% konfluencji i obserwować komórki w czwartym dniu. Następnie, w czwartym dniu, dodać poly brain do zebranej pożywki zawierającej cząsteczki wirusa i dokładnie wymieszać za pomocą pipety.

Następnie odessaj pożywkę z trzech komórek T3 i dodaj jeden mililitr mieszaniny wirusowej do każdej studni. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc. Po jednokrotnym przemyciu komórek PBS, uzupełnij pożywkę i inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez noc w celu regeneracji i wzrostu. Po osiągnięciu konfluencji rozdziel komórki i hoduj je przez noc dnia następnego.

Aby rozpocząć selekcję zainfekowanych komórek, należy dodać świeżą pożywkę zawierającą 10 µg/mL blastycydyny. Stężenie blastycydyny niezbędne do wyeliminowania komórek musi zostać empirycznie określone dla każdej linii komórkowej. Pożywkę zawierającą blastycydynę należy uzupełniać co dwa do trzech dni w celu ciągłej selekcji komórek opornych na antybiotyk.

Ekspresja reporterów zegara. Po namnożeniu kultury komórek reporterowych opornych na blastycynę w 35 milimetrowych naczyniach hodowlanych do momentu uzyskania konfluencji, zazwyczaj przygotowujemy trzy lub więcej naczyń dla każdej linii komórek reporterowych w każdym wariancie warunków w celu analizy fenotypu. Po jednym przemyciu PBS dodajemy DMEM zawierający 10 µM forlinu lub 200 nM deksametazonu i inkubujemy w 37 °C przez jedną godzinę, aby zsynchronizować komórki.

Następnie przenieś komórki do świeżo przygotowanego medium rejestracyjnego. Przykryj szalki hodowlane sterylnymi szkiełkami zakrywowymi o średnicy 40 mm i uszczelnij je smarem próżniowym, aby zapobiec odparowywaniu. Umieść szalki w luminometrze lumous cycle i rozpocznij pomiar bioluminescencji w czasie rzeczywistym.

Rejestracja. Do rejestracji 96 starej płytki. Z urządzeniem rejestrującym GSR dwa należy zapoznać się z dołączonym rękopisem. Rytm rejestrowano bez trudności przez pięć do siedmiu dni w programie do analizy cykli lum.

W pierwszej kolejności dopasowano linię bazową do surowych danych. Następnie dane po odjęciu linii bazowej dopasowano do fali sinusoidalnej w celu wyznaczenia wymaganych parametrów dla próbek wykazujących trwałe rytmy. Dobroć dopasowania danych powyżej 90% jest łatwo osiągalna ze względu na wysoką luminescencję przejściową.

Pomiar i wymiana medium. Zazwyczaj wykluczamy z analizy dane z pierwszego cyklu w celu prezentacji wyników. W razie potrzeby przedstawiamy surowe dane w funkcji czasu.

Nanieś dane po odjęciu linii bazowej, aby porównać amplitudę i fazę zarówno w przejściowej transfekcji komórek 2 9 3 T, jak i w infekcji linii komórkowych. Obrazy fluorescencyjne transfekowanych i transdukowanych komórek wykazujących ekspresję GFP wskazują, że system dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusów jest wysoce wydajny. Główna pętla sprzężenia zwrotnego zegara okołodobowego składa się z czynników transkrypcyjnych, które oddziałują na elementy wzmacniające rytm okołodobowy w celu wywołania rytmicznej ekspresji genów.

W niniejszym doświadczeniu cztery różne konstrukty reporterowe w trzech liniach komórek T3 generują odrębne fazy ekspresji reportera. Nowe fazy pośrednie mogą zostać uzyskane dzięki regulacji kombinatorycznej z wykorzystaniem wielu elementów okołodobowych, stosując wyciszanie genów poprzez RNAi oraz związki farmakologicznie aktywne. W eksperymencie wykorzystano luminometr Lum Cycle do rejestracji bioluminescencji komórek U2 OS w naczyniach o średnicy 35 mm.

Do wyjaśnienia efektów wyciszenia genów cry one i cry two wykorzystano irna. Do rejestracji bioluminescencji komórek użyto luminometru synergetycznego. W płytce 96-dołkowej zastosowano trzy linie komórek reporterowych T trzy.

Do oceny wpływu potrójnego wyciszenia genów na rytmy komórkowe wykorzystano cząsteczki RNA. W tym przykładzie do rejestracji bioluminescencji komórek w płytkach 384-dołkowych wykorzystano system UX oraz luminometr Tecan. W wybranych płytkach zastosowano małe cząsteczki, które mogą farmakologicznie celować w funkcje białek i zaburzać rytmy komórkowe w komórkach reporterowych U2 OS.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaniom w dziedzinie biologii rytmów okołodobowych, umożliwiając zgłębianie mechanizmów zegarowych oraz fizjologii w różnych typach komórek i tkanek. Po obejrzeniu tego filmu widz powinien dobrze zrozumieć, jak generować linie komórkowe raportujące lucyferazę oraz jak monitorować ich aktywność.

Należy pamiętać, że praca z wirusem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie środków ochrony osobistej oraz dekontaminacja wirusowa.