Analiza ekspresji genów bakteryjnych z wykorzystaniem mikromacierzy

Cześć, nazywam się Ena. W naszym laboratorium regularnie przeprowadzamy profilowanie ekspresji genów. Technikę tę wykorzystujemy do monitorowania genów różnicowo regulowanych pomiędzy typem dzikim a próbkami z mutacją meth. Dzisiaj dysponuję próbkami RNA typu dzikiego oraz meth i w pierwszej kolejności przeprowadzimy analizę cDNA.

Stosujemy metody znakowania pośredniego, a zaletą tej techniki jest zapobieganie błędowi obserwatora, który może wystąpić przy znakowaniu bezpośrednim. W tym celu przygotowujemy próbki RNA, dążąc do uzyskania 3 µg RNA w całkowitej objętości 13 µL. Następnie dodajemy 2,5 µg random hexamers do naszych próbek.

Próbkę inkubujemy w temperaturze 75°C przez 8 minut, aby zdenaturować RNA. Następnie dodajemy koktajl do odwrotnej transkrypcji zawierający mieszankę dNTP, bufor odwrotnej transkrypazy oraz odwrotną transkrypazę. Po wymieszaniu próbki w wirówce, inkubujemy ją w temperaturze 42°C przez 4 godziny. Po upływie 4 godzin wyjmujemy próbki.

Obecnie w probówce znajduje się mieszanina cDNA i RNA. Naszym celem jest przeprowadzenie hydrolizy RNA poprzez dodanie wodorotlenku sodu oraz EDTA; stężenie końcowe wodorotlenku sodu powinno wynosić 100 mM, a stężenie końcowe EDTA powinno wynosić 5 mM.

Teraz będziemy inkubować próbki w kąpieli wodnej o temperaturze 65 °C przez 10 minut. Inkubacja dobiegła końca i teraz przygotujemy próbki, dodając wodę HEPES o pH 7 do stężenia końcowego 500 mM. Na tym etapie próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C lub kontynuować proces oczyszczania.

Do oczyszczania cDNA używamy zestawu KaiGen PCR purification kit. Ponieważ jednak bufor Bush oraz bufor jonowy zawierają związki uwalniające, przygotowujemy własny bufor Phosphate Bush oraz bufor Phosphate Ion, dodając 300 µL PPI. Następnie powoli pipetujemy tę mieszaninę do kolumn i wirujemy przez jedną minutę z maksymalną prędkością. Używając przygotowanego buforu płuczącego Phosphate wash buffer, dodajemy 750 µL i powtarzamy ten proces ponownie.

Odwirujemy próbki ponownie, aby upewnić się, że cały osad został uformowany. Następnie przeniesiemy te probówki do pustych probówek typu Eppendorf. Dodam 30 µL buforu fosforanowego E, który składa się z 40 mM fosforanu potasu o pH 8,5.

W tym kroku należy upewnić się, że wszystko zostało dodane do środka kolumny, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Próbka zostanie ponownie wirowana przez jedną minutę, po czym dodam kolejne 30 µL buforu i inkubuję w temperaturze pokojowej. Następnie wyjmuję kolumnę; całkowita objętość wynosi 60 µL CDA.

Po oczyszczeniu cDNA można je przechowywać w temperaturze -20 °C lub można je wysuszyć, a następnie przechowywać; cDNA można zatem wysuszyć w procesie sprzężenia zwrotnego. W probówce znajduje się teraz suche cDNA, które zostało zmodyfikowane. To, co teraz zrobię, to zawieszenie suchej próbki w.

Próbkę zawieszę w 10 µL 15 mM wodorowęglanu sodu o pH 9. Zrobię to, pipetując w górę i w dół; na tym etapie bardzo ważne jest dokładne resuspensowanie cDNA. Aby reakcja wiązania korporacyjnego przebiegła pomyślnie, reakcja ta powinna odbywać się w ciemni, ponieważ znaczniki fluorescencyjne są wrażliwe na światło.

Jednakże, wybierając te z nauk o życiu, okazało się, że są one w indywidualnych opakowaniach. S5 ma fioletową zakrętkę, a S3 ma pomarańczową zakrętkę; ponadto S5 wydaje się być cyjanowy po zawieszeniu, a Cary wydaje się być purpurowy. Dlatego w ciemni przeniosę te próbki do probówek z barwnikiem, ponownie zawieszę barwnik i przeniosę go z powrotem do posiadanej przeze mnie probówki.

Następnie inkubuję w ciemności przez dwie godziny. Po dwóch godzinach inkubacji zatrzymuję reakcję, dodając 35 µL 100 mM octanu sodu o pH 5,2. Po tym kroku przeprowadziliśmy oczyszczanie przy użyciu podobnej procedury oczyszczania. Tym razem jednak zastosowaliśmy dostarczone przez producenta bufory do przemywania i elucji.

Można opisać miejsca, w których umieszcza się próbkę, co powinno oczyścić instrument. Możecie teraz wprowadzić swoją próbkę lub mieszaninę. To jest moja próbka znakowana scifi; tutaj widzimy OD 260, która wskazuje zawartość DNA, oraz OD 650, która wskazuje wbudowanie D dla scifi. A tutaj znajduje się moja próbka znakowana side three.

Ponownie obróć sześć stężeń i pięć pomiarów 50 w miejscu trzech włączeń. Ponieważ moja korporacja D działa wydajnie, połączę teraz próbki. Wymieszaj je krótko. A teraz ponownie pobierzemy próbkę, korzystając z informacji zwrotnej.

Zatem w celu przygotowania slajdu, przeprowadzimy rehydratację, kładąc slajd na wodzie, co spowoduje powiększenie plamek. Następnie, aby je zabezpieczyć, wysuszymy je gwałtownie w temperaturze 100 °C, a potem przeprowadzimy hybrydyzację UV lub sieciowanie UV plamek ze slajdem, po czym inkubujemy w przygotowanym buforze przedhybrydyzacyjnym. Kładę slajd stroną roboczą w dół, ale tak, aby nie dotykał jeszcze wody.

W ten sposób odczekamy pięć minut. To pole wygląda na większe, powinny być one bardziej błyszczące niż przed nałożeniem, a następnie wysuszymy preparat, kładąc slajd w temperaturze 100 °C, i będziemy obserwować kondensację. Następnie przeprowadzimy sieciowanie za pomocą youi.

Aby przeprowadzić hydratację, zanurzam preparat w wodzie przedodgrzewanej. Proces ten powinien przebiegać bardzo szybko, ponieważ celem jest usunięcie wszystkich plamek lub wszystkich oligonukleotydów z plamki, które nie są sprzężone. Jeśli proces ten będzie przebiegał zbyt wolno, w miejscu plamek powstaną tzw. ogony komet.

Należy upewnić się, że czynność ta jest wykonywana szybko i że próbka nie zostanie wyjęta z wody; należy powtarzać te czynności przez 30 s, a następnie natychmiast inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min przy 700 rpm. Następnie wkładamy ten slajd do wcześniej przygotowanego buforu stacjonarnego, powoli wsuwając go do słoika, i inkubujemy w temperaturze 42°C przez co najmniej 45 min. Oto nasz wysuszony preparat do hybrydyzacji. W pierwszej kolejności należy go resuspendować w wodzie.

Na tym etapie zawiesinę resuspendujemy, pipetując ją w górę i w dół, unikając nadmiernej ekspozycji próbki na światło. Następnie dodaje się 1,5 µL DNA plemników o stężeniu 10 mg/ml oraz 1,2 µM tRNA.

Stężenie wynosi 12,5 mg/ml; dodajemy tRNA oraz niewielką ilość DNA plemników, aby zablokować niespecyficzną hybrydyzację. Następnie dodajemy 5,35 µl znacznika 0,3 XSSC, co daje stężenie końcowe 3x. Na koniec dodajemy 3,5 µl 1% SDS.

Teraz będziemy gotować mieszaninę przez pięć minut, a następnie odwirować ją z maksymalną prędkością przez pięć minut, po czym będzie gotowa do użycia. Minęła godzina od inkubacji preparatu i w tej chwili mam przygotowaną wodę oraz izopropanol. Najpierw będę potrząsać preparatem w wodzie, aby usunąć SDS, a następnie przemyję go izopropanolem i umieszczę bezpośrednio w standardowym uchwycie.

W tym kroku należy uważać, aby nie wystawiać preparatu zbyt długo na działanie powietrza, co zapobiegnie jego wysychaniu. Przenoszę więc preparat bezpośrednio z buforu stacji HARM do wody i płuczę slajd. Płukanie trwa kilka minut; należy upewnić się, że ruch odbywa się wyłącznie w górę i w dół, a nie na boki.

Należy również upewnić się, że preparat nie znajduje się nad powierzchnią wody, a następnie natychmiast przenieść go do izopropanolu. Powinien on pozostać w nim przez kilka minut. Proszę pozostawić preparat w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

700 R.Cool. Nasze szkiełko jest zatem gotowe do hybrydyzacji; najlepiej przechowywać je w kasetce do szkiełek, aby chronić je przed kurzem. Do stacji zbioru użyjemy liftu lub slipu.

Na szkiełku nakrywce znajdują się białe paski, które zapewnią odpowiedni dystans oraz przestrzeń dla próbki pomiędzy szkiełkiem nakrywką a preparatem. Oczyszczam je etanolem, a następnie kładę szkiełko, upewniając się, że nie ma na nim żadnych zanieczyszczeń. Najpierw bierzemy nasz slajd szablonowy z zaznaczonym obszarem drukowania, a na nim umieszczamy przygotowane szkiełko, dbając o ich idealne dopasowanie.

Upewnij się, że są idealnie wyrównane. Musisz również upewnić się, że paski znajdują się po stronie, którą położymy skierowaną do dołu. Jest to bardzo trudne do zauważenia, ale upewnij się, że są widoczne.

Paski powinny znajdować się po bokach szkiełek. Próbkę będziemy nanosić od boków. Pobieram niewielkie ilości próbki, zaczynając od 15 µL, a następnie rozpoczynam nanoszenie od rogu szkiełka nakrywkowego.

Następnie powoli wciągam próbkę i przesuwam się wzdłuż krawędzi, aby pokryć cały obszar. Na tym etapie bardzo ważne jest, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza; nakładam kolejnych 15 µL migratora na boki szkiełek, aby zapobiec wysychaniu. Nasza próbka jest gotowa; teraz należy inkubować szkiełka w komorach do hybrydyzacji, które posiadają mikrokanały nawilżające szkiełko podczas procesu hybrydyzacji.

Następnie dodamy po 10 µL 3X SSC w sześciu narożnikach szkiełka. W komorze znajduje się sześć miejsc: w każdym narożniku oraz po obu bokach. Należy przenieść szkiełko bardzo delikatnie, abyt szkiełko nakrywki nie przesunęło się. Po położeniu szkiełka stroną górną do góry zauważą Państwo, że przylgnie ono do naniesionej wody i nakrywki. Należy upewnić się, że śruby są mocno dokręcone.

Komorę konwersacyjną będziemy inkubować w worku z wodą o temperaturze 65 °C, jednak nie chcemy kłaść jej bezpośrednio na dnie. Dlatego umieścimy rodzaj plastikowej bariery, aby zapobiec nadmiernemu transferowi ciepła. Następnie ostrożnie umieszczamy komorę izacyjną, a aby zapobiec jej przesunięciu, można zastosować odpowiednie obciążenie.

Inkubacja ta będzie trwała przez noc, zazwyczaj od 10 do 12 godzin. Do płukania skrawka używamy roztworu 1x SSC z dodatkiem 0,05% SDS. Służy on do usunięcia szkiełka nakrywki.

To będzie pierwszy etap płukania. Następnie wykonamy dwa kolejne etapy, używając wyłącznie 0,06% six XSC zamiast całego SDS, którym dysponujemy. Zatem po zakończeniu rozmowy bierzemy szkiełka i umieszczamy je stroną roboczą do dołu w pojemniku.

Następnie delikatnie potrząśniemy próbką z boku na bok, aż szkiełko nakrywki samo odpadnie. Następnie przeniesiemy preparat do kolejnego buforu płuczącego zawierającego XES. Odczekamy jedną minutę.

Przejdźmy do etapu 06 XSSC. Aby upewnić się, że usunęliśmy wszystkie FDS, powtórzymy tę czynność jeszcze raz. Wirowanie w celu osuszenia przeprowadzono w temperaturze pokojowej przez pięć minut przy 700 RP. Przechowuj ten preparat w kasecie na szkiełka, ponieważ jest on światłoczuły.

Oto skaner preparatów; preparat należy umieścić tutaj, w tym małym miejscu, kładąc go stroną z próbką do dołu, a etykietą w stronę wskazaną. W przypadku drugiego preparatu należy po prostu zdefiniować obszar, który ma zostać zeskanowany. Wybieramy ten obszar w naszych preparatach. Do przygotowania naszych preparatów wykorzystujemy 16 pinów.

Zatem każdy blok odpowiada jednemu pinowi, a nasze płytki zawierają ponad 8 000 punktów. Reprezentujemy genom w dwóch kolorach, ponieważ składa się on z około 4 000 genów. W związku z tym dla każdego użytego oligonukleotydu mamy dwa punkty.

Przy powiększeniu widać, że w tym konkretnym eksperymencie porównujemy mutanty regulatora transkrypcji z typem dzikim; mutanty zostały oznakowane scifi, co nadaje czerwony kolor, natomiast typ dziki został oznakowany site three, co nadaje kolor zielony. Zatem wszystko, co wydaje się czerwone, jak te punkty, wskazuje na to, że obfitość transkryptów u mutanta była wyższa niż u typu dzikiego.

W związku z tym wykazują one kolor czerwony lub jego odcienie, natomiast wszystko, co pojawia się w kolorze zielonym, wskazuje na to, że obfitość transkryptu była wyższa w typie dzikim w porównaniu do mutanta. Każda plamka o kolorze żółtym oznacza, że dany transkrypt występował w równym stopniu zarówno u mutanta, jak i w typie dzikim. Zatem w miejscu ich nałożenia pojawiają się one w kolorze żółtym, tak jak w tych punktach.