Modele przerzutów do kości

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wstrzyknięcie komórek nowotworowych w sposób, który wywoła ich wzrost w kości i następczą destrukcję tkanki kostnej. Osiąga się to poprzez uprzednie zawieszenie komórek nowotworowych w zimnym PBS i umieszczenie ich na lodzie. Następnie odpowiednią liczbę komórek wstrzykuje się do lewej komory serca lub do kości piszczelowej znieczulonej myszy.

Następnie wzrost guza kostnego oraz parametry kostne są monitorowane wzdłużnie za pomocą wielu technik obrazowania. Na koniec przeprowadzana jest ilościowa ocena parametrów guza i kości w punkcie końcowym. Ostatecznie stosuje się kombinację fluorescencji lub luminescencji in vivo i ex vivo, radiografii 2D oraz obrazowania 3D.

MikrotK oraz histologia są wykorzystywane do obrazowania wzrostu guza oraz zmian w mikrośrodowisku kostnym na poziomie komórkowym i strukturalnym. Metody te mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie przerzutów nowotworowych, takie jak czynniki w kości umożliwiające kolonizację przerzutową raka piersi i prostaty. Przygotowanie komórek zaprezentuje Alisa Merkel, asystentka badawcza w moim laboratorium; utrzymuj komórki przez mniej niż jeden tydzień.

Klon linii MDA-MB-231 z oznakowaniem GFP hodowano w pożywce DMEM zawierającej 10% FBS oraz 0,1 mg/ml penicyliny i streptomycyny w temperaturze 37°C w atmosferze 5-8% CO2. Komórki pasażowano przy 80-90% konfluencji, stosując rozcieńczenie od 1:10. W celu przygotowania komórek do szczepienia, przy 80-90% konfluencji, poddano je trypsynizacji przy użyciu 10 ml 0,15% trypsyny-EDTA.

Przenieść natychmiast komórki do probówki stożkowatej o pojemności 50 ml z lodowatym DMEM z dodatkiem 10% FBS i wirować przez pięć minut. Resuspendować osad w probówce stożkowatej o pojemności 50 ml w 25 ml lodowatego PBS bez wapnia i magnezu, a następnie policzyć komórki. Przeszczepić komórki i resuspendować w lodowatym PBS do stężenia 10⁶ komórek/ml dla inokulacji wewnątrzsercowej oraz 250 000 komórek/ml dla wstrzyknięcia wewnątrzpiszczelowego.

W eksperymentach tych wykorzystuje się samice myszy z niedoborem odporności w wieku od czterech do sześciu tygodni, które przez okres od pięciu do 10 dni przed iniekcją były karmione dietą Tela 29 20 x. Po znieczuleniu myszy w komorze przy użyciu 2,5% isofluorenu, należy przenieść zwierzę pod dygestorium do maski nosowej i ułożyć je na grzbiecie. Klatkę piersiową należy przemyć 10% roztworem powidonu jodowego, a następnie 70% Ethanolem.

Zaznacz miejsce wstrzyknięcia na klatce piersiowej myszy w połowie odległości między wcięciem mostka a górną krawędzią wyrostka mieczowatego, lekko po lewej stronie mostka. Następnie, używając strzykawki insulinowej o pojemności 300 µL z igłą 28G o długości 1/2 cala, nabierz niewielką pęcherzykiem powietrza, aby stworzyć przestrzeń między tłokiem a meniskiem, a następnie pobierz 100 µL zawiesiny komórkowej, trzymając skórę myszy w naciągu jedną ręką.

Utrzymaj igłę pionowo; prawidłowe wprowadzenie jej do lewej komory serca powinno spowodować pojawienie się w strzykawce wyraźnego, jasnoczerwonego impulsu krwi. Na tej głębokości ostrożnie wciśnij tłok strzykawki, unikając znaczących ruchów igły, aby nie przebić serca i nie doprowadzić do wycieku komórek do jamy klatki piersiowej. Aby ograniczyć ściekanie komórek do jamy klatki piersiowej, lekko pociągnij tłok do góry, aby wytworzyć niewielkie podciśnienie.

Następnie wyciągnij igłę bezpośrednio z klatki piersiowej, uważając, aby nie przechylić jej podczas usuwania, co mogłoby doprowadzić do przerwania osierdzia i wykrwawienia. Przez około jedną minutę wywieraj lekki nacisk w miejscu wstrzyknięcia, aby ograniczyć krwawienie. Po zdjęciu stożka nosowego przenieś mysz na podkładkę grzewczą, aż odzyska pełną przytomność.

Bezpośrednio przed procedurą wewnątrzpiszczelową podaj myszy buprenorfinę. Po znieczuleniu myszy i umieszczeniu jej w stożku nosowym, oczyść obie kończyny za pomocą 10% jodopowidonu, a następnie etanolu, wykonując ruchy czterema palcami i kciukiem.

Delikatnie chwyć kostkę boczną, kostkę przyśrodkową oraz dolną połowę kości piszczelowej. Następnie zegnij nogę tak, aby kolano było widoczne i dostępne. Używając 70% etanolu, zwilż skórę w celu zwiększenia widoczności leżącego pod nią więzadła rzepki, które powinno być widoczne jako wyraźna, gruba biała linia podczas mocnego trzymania stawu skokowego.

Wprowadź igłę 28G o długości pół cala pod rzepkę, przez środek więzadła rzepki, do przedniego obszaru międzykłykciowego w górnej części piszczeli. Stosując stały, mocny nacisk z lekkim ruchem wiercącym, ostrożnie przeprowadź igłę przez płytkę wzrostową. Po przebiciu się przez płytkę wzrostową piszczeli opór stawiany igle wyraźnie zmaleje.

Wykonaj delikatny ruch igły w kierunku bocznym, aby upewnić się, że znajduje się ona w kości piszczelowej i przeszła przez płytkę wzrostu. Ruch będzie ograniczony, jeśli igła znajduje się w odpowiednim miejscu w obrębie kości piszczelowej. Powoli naciśnij tłok, aby wstrzyknąć 10 µL zawiesiny komórek.

W tym momencie nie powinno być odczuwalnego oporu lub powinno być on znikome. Następnie powoli wyciągnij igłę. Wybudź mysz z anestezji i trzymaj ją na podgrzewaczu, aż do momentu pełnego wybudzenia.

Monitoruj mysz dwa do trzech razy w tygodniu. U znieczulonych myszy przeprowadza się różne techniki obrazowania, takie jak lucyferaza, fluorescencja GFP i promieniowanie rentgenowskie. Fluorescencja wskazuje obszary guza.

Skan estron jest wykorzystywany do lokalizacji zmian. Zmiany te korelują z obrazami fluorescencyjnymi. Dalsze szczegóły dotyczące technik obrazowania znajdują się w pisemnej części niniejszego protokołu.

Od 21 do 35 dni po wstrzyknięciu. Uśmierć myszy metodą zatwierdzoną przez IACUC i przechowuj kości w 4% Formalinie; przeprowadź analizę ex vivo za pomocą mikro-CT oraz analizę histomorfologiczną z barwieniem hematyksyliną i eozyną (H&E) oraz barwieniem DSN na wyizolowanych kościach. Szczegóły znajdują się w protokole pisemnym dotyczącym inokulacji komórek nowotworowych drogą wewnątrzsercową lub wewnątrzpiszczelową.

Myszy są monitorowane co tydzień za pomocą radiografii oraz fluorescencji lub luminescencji. Zmiany zwykle stają się widoczne w promieniach rentgenowskich między drugim a trzecim tygodniem. Chociaż mogą być widoczne w fluorescencji i luminescencji już w drugim tygodniu, w zależności od modelu pokazanego tutaj, zmiany są widoczne jako ciemne ubytki w kości i mogą z czasem stawać się bardziej wyraźne. Zmiany ilościowo określono za pomocą analizy radiogramów i obrazów fluorescencyjnych w programie Metamorph.

Ilościowo określono przy użyciu oprogramowania do akwizycji i analizy obrazowania Maestro. Na tej rycinie utrata kości została określona ilościowo za pomocą analizy mikro-CT. Dane o strukturze i mineralizacji kości z pomiarów mikro-CT przedstawiono jako obrazy 3D zdrowej kości oraz kości z nowotworem, gdzie obszary destrukcji kości widoczne są jako puste przestrzenie.

Następnie w próbkach przeprowadzono analizę histomorfometryczną w celu określenia obciążenia nowotworem oraz stosunku objętości kości do objętości tkanki. Podczas wykonywania tych procedur ważne jest zachowanie cierpliwości i staranne ułożenie każdej myszy oraz uważne monitorowanie zwierząt. Jeśli myszy zaczną ginąć, prawdopodobnie jest to spowodowane agregacją komórek i należy niezwłocznie przygotować nową zawiesinę komórek.

Najgorszym rozwiązaniem jest pośpiech przy wykonywaniu procedur lub uleganie frustracji. Pamiętaj, że wraz z praktyką i czasem będziesz działać coraz sprawniej i szybciej. Opracowanie tych technik otworzyło badaczom nowotworów drogę do badania przerzutów do kości in vivo.