Rejestracja za pomocą barwników napięciowo-czułych z aksonów, dendrytów i kolców dendrytycznych pojedynczych neuronów w skrawkach mózgu
29 listopada 2012
Opisano technikę obrazowania służącą do monitorowania zmian potencjału błonowego z rozdzielczością przestrzenną poniżej mikrometra i rozdzielczością czasową poniżej milisekundy. Technika ta, oparta na wzbudzaniu laserowym barwników wrażliwych na napięcie, umożliwia pomiar sygnałów w aksonach i kolaterałach aksonalnych, końcowych gałęziach dendrytycznych oraz pojedynczych kolcach dendrytycznych.
Ogólnym celem opisanych eksperymentów jest optyczny monitoring integracji sygnału potencjału błonowego oraz przetwarzania informacji przez pojedynczą komórkę nerwową z rozdzielczością submikrometryczną i submilisekundową w wielu miejscach neuronu. Osiąga się to poprzez budowę układu obrazowania o odpowiedniej czułości, pozwalającego na rejestrację niewielkich zmian frakcyjnych natężenia światła odpowiadających przejściowemu potencjałowi błonowemu. Następnie wybiera się neurony o odpowiedniej anatomii, umożliwiającej efektywne obrazowanie neuronów z długimi, nienaruszonymi wypustkami w jednej płaszczyźnie ogniskowania blisko powierzchni skrawka.
Następnie należy załadować wyselekcjonowane neurony barwnikami napięciowo-czułymi, aby umożliwić optyczne śledzenie zmian potencjału błonowego. Wyniki wykazują wyjątkową zdolność tej metody do uzyskiwania informacji o integracji sygnałów elektrycznych przez pojedyncze komórki nerwowe poprzez monitorowanie sygnałów potencjału błonowego z aksonów, dendrytów i kolców dendrytycznych. W neurofizjologii komórkowej.
Nowe narzędzia są opracowywane ze względu na dwa wieloletnie ograniczenia konwencjonalnej elektrofizjologii: niską rozdzielczość przestrzenną pomiarów elektrodowych oraz brak możliwości rejestracji sygnałów z małych struktur, takich jak kolaterale aksonalne czy kolce dendrytyczne. Aby przezwyciężyć te wady, podejście z wykorzystaniem elektrody patch może być łączone z technikami optycznymi, które umożliwiają równoległą rejestrację z wszystkich części neuronu. W niniejszym opracowaniu opisujemy taką technikę – wielostronną optyczną rejestrację przejściowych zmian potencjału błonowego z rozdzielczością pojedynczego kolca.
W tym doświadczeniu wykorzystano mikroskop pionowy oraz trzy kamery w celu dostosowania jednorodnego oświetlenia. Najpierw należy umieścić odpowiedni filtr neutralny w torze wiązki lasera. Następnie należy ustawić ostrość obiektywu na powierzchni standardowego preparatu fluorescencyjnego.
Obserwując obraz pola widzenia z kamery CCD na ekranie monitora, należy dostosować pozycję końcówki odbiorczej kwarcowego światłowodu oraz pozycję końcówki wyjściowej światłowodu za pomocą odpowiednich elementów sterujących w kondensorze epifluorescencyjnym, aby uzyskać scentrowane i jednorodne oświetlenie pola widzenia. W celu określenia szumu wibracyjnego należy użyć standardowego preparatu fluorescencyjnego z niefluorescencyjnym oznaczeniem na powierzchni. Intensywność światła należy rejestrować za pomocą neuro CCD w trybie ciągłym.
Ustaw obiektyw na ciemną krawędź czarnego znaku i zarejestruj natężenie światła przez około 100 milisekund przy częstotliwości klatek dwóch kiloherców. Następnie wyświetl średnią przestrzenną śladów względnego natężenia światła z około 20 pikseli odbierających światło z obszaru równomiernie oświetlonego oraz z około 20 pikseli wzdłuż krawędzi czarnego znaku. Nadmiarowy szum w średniej przestrzennej z pikseli o krawędziach o wysokim kontraście odzwierciedla szum wibracyjny w układzie.
Niezbędne jest zamontowanie migawki mechanicznej poza stołem izolacyjnym, aby jej otwieranie nie wprowadzało szumów wibracyjnych do rejestracji optycznej. Jest to krok krytyczny. Zamontuj migawkę za pomocą plastikowych śrub oraz materiałów izolujących od wibracji, aby zredukować akustyczny szum wibracyjny, który mógłby zostać wychwycony przez system rejestracji optycznej.
Aby wyizolować drgania, należy regulować stół antywibracyjny do momentu, gdy szum wibracyjny pikseli obejmujących ostrą krawędź obrazu stanie się mniejszy od szumu śrutowego. Przewody sprzętowe na stole muszą być ułożone luźno, aby uniknąć przenoszenia drgań mechanicznych na tubus mikroskopu. W ramach tej procedury, przy użyciu systemu konfokalnego z wirującą tarczą, należy przygotować skrawki mózgu o grubości od 300 do 400 µm zgodnie ze standardowymi procedurami, wykorzystując linię myszy wykazującą ekspresję EGFP w wybranych komórkach nerwowych.
Wizualizuj neurony znakowane EGFP w skrawku. Następnie wybierz neurony z nienaruszonymi drzewami dendrytycznymi i aksonalnymi, których wypustki biegną równolegle i blisko powierzchni skrawka, w celu obrazowania potencjału błonowego. Następnie napełnij szklaną pipetę patch od strony końcówki roztworem wewnątrzkomórkowym bez barwnika, aż do dwóch trzecich zwężenia elektrody, przykładając podciśnienie przez około 15 sekund.
Następnie wypełnij ponownie elektrodę roztworem zawierającym barwnik wrażliwy na napięcie błony IMP rozpuszczony w roztworze wewnątrzkomórkowym. Teraz, w ciągu jednej minuty od wprowadzenia barwnika do elektrody, wykonaj patch wcześniej wybranego neuronu. Przed opuszczeniem pipety do kąpieli zastosuj niskie dodatnie ciśnienie o wartości około 10 mmHg; podczas pozycjonowania elektrody w plastrze zapewnia to, że barwnik nie wycieknie z elektrody przed utworzeniem uszczelnienia.
Zwiększ ciśnienie do wysokiego poziomu, około 100 milimetrów słupa rtęci, tuż przed kontaktem elektrody z powierzchnią komórki. Po uzyskaniu szczelności w konfiguracji whole cell, pozwól barwnikowi swobodnie dyfundować z pipety somatic patch do somy przez 20 do 45 minut. Podczas dyfuzji barwnika monitoruj stan fizjologiczny neuronu, rejestrując wywołane potencjały czynnościowe w trybie current clamp.
Dodatkowo monitoruj stopień barwienia, rejestrując intensywność światła spoczynkowego z somy komórki przy częstotliwości klatek dwóch kilohertz i przy ułamku pełnej intensywności światła dostosowanym za pomocą filtrów neutralnych. Kontynuuj proces pobierania danych, aż potencjał czynnościowy zacznie się poszerzać. Po zakończeniu barwienia ostrożnie odsuń pipetę patchową od somy w konfiguracji voltage clamp, aby zapewnić przejście z konfiguracji whole cell do konfiguracji outside-out patch w tym procesie.
Następnie inkubuj skrawek przez dodatkowe 1,5 do dwóch godzin w temperaturze pokojowej, aby barwnik wrażliwy na napięcie mógł rozprowadzić się w wypustkach neuronalnych. Po tym, jak znaczna ilość barwnika przemieści się z somy do wypustek dendrytycznych i aksonalnych, kształt fali potencjału czynnościowego powinien zostać całkowicie przywrócony. W kolejnym kroku zlokalizuj somę zabarwionego neuronu przy użyciu fluorescencji o niskim natężeniu.
Zmniejsz natężenie światła za pomocą filtrów neutralnych do minimum wymaganego do wizualizacji badanego obiektu przy użyciu stolika XY. Skanuj obszar skrawka zawierający fluorescencyjny neuron, aż do zidentyfikowania fluorescencyjnego ciała komórki. Umieść ciało komórki barwionej komórki w centrum pola widzenia mikroskopu i wykonaj patch neuronu przy użyciu standardowej elektrody do patch-clampu bez barwnika w trybie DIC. Następnie wizualizuj wypustki neuronalne przy niskim natężeniu fluorescencji z częstotliwością klatek od 10 do 40 Hz w trybie ciągłego zapisu kamery CCD w celu obrazowania napięcia.
Używając stolika XY, ustaw interesujący nas wypustek neuronalny na środku obszaru obrazowania. Dodatkowo, aby zminimalizować uszkodzenia fotodynamiczne, osłoń SOMA przed światłem wzbudzenia, korzystając z częściowo zamkniętej przysłony ograniczającej pole widzenia mikroskopu. Następnie zarejestruj sygnały optyczne związane z wstecznie propagującymi potencjałami czynnościowymi w poszczególnych gałęziach dendrytycznych.
Następnie zarejestruj sygnały optyczne związane z potencjałami czynnościowymi w aksonie. Po tym zarejestruj sygnały optyczne związane z wstecznie propagującymi się potencjałami czynnościowymi w kolcach dendrytycznych. Użyj odpowiedniej częstotliwości klatek w celu dokładnej rekonstrukcji kształtu fali sygnału.
Jednocześnie należy utrzymać okresy rejestracji oraz ekspozycję na wysokointensywne światło wzbudzenia na możliwie najkrótszym poziomie, aby zminimalizować blaknięcie barwnika i uszkodzenia fotodynamiczne. Tutaj przedstawiono rejestrację sygnałów optycznych. Górny panel pokazuje obraz konfokalny o wysokiej rozdzielczości zabarwionego neuronu z aksonem w pozycji rejestracyjnej.
Podczas gdy środkowy panel przedstawia obraz fluorescencyjny aksonu o niskiej rozdzielczości przestrzennej, uzyskany za pomocą CCD wykorzystywanego do obrazowania potencjału błonowego, dolny panel prezentuje rejestracje elektrodowe z somy oraz rejestracje optyczne z A IS i węzła rvi. Przedstawiono surowe dane oraz przetworzone sygnały. Rysunek ten ukazuje sygnały potencjałów czynnościowych z aksonu neuronu kory warstwy L5 obciążonego barwnikiem wrażliwym na napięcie action.
Potencjalne sygnały powiązane rejestrowano z częstotliwością próbkowania 10 kHz. Ślady te wskazują na przejście potencjału czynnościowego z trzech lokalizacji. Pierwszą jest elektroda rejestrująca sygnał z somy.
Po drugie, rejestracje optyczne z pagórka aksonu, a po trzecie, rejestracja optyczna z pierwszego węzła Vie; tutaj przedstawiono nałożone na siebie sygnały z tych samych trzech lokalizacji. Rysunek ten przedstawia serię czterech sygnałów wstecznie propagujących potencjałów czynnościowych z wielu lokalizacji w drzewie dendrytycznym neuronu kory warstwy L5, zainicjowanych krótkimi depolaryzującymi impulsami prądowymi o częstotliwości 100 Hz. Przedstawione są tutaj sygnały potencjału czynnościowego z pojedynczej kolca dendrytycznego.
Oto rekonstrukcja anatomiczna uzyskana z zestawu obrazów konfokalnych z dyskiem obrotowym, a tutaj znajduje się obraz fluorescencyjny tego samego obszaru uzyskany za pomocą kamery CCD. W przypadku obrazowania potencjału błonowego, na prawym panelu przedstawiono przebiegi natężenia fluorescencji odpowiadające wstecznie propagującym się potencjałom czynnościowym z lokalizacji od pierwszej do trzeciej, zaznaczonych na obrazie CCD. Dolny przebieg wskazuje zapis z elektrody umieszczonej w somie.
Przygotowanie przed rejestracją trwa około trzech godzin, wliczając w to czas oczekiwania na rozprzestrzenienie się kostek na wypustki dystalne. Czas rejestracji jest ograniczony przez naturalny spadek aktywności preparatu oraz uszkodzenia fotodynamiczne wywołane przez PO. Stopień uszkodzeń fotodynamicznych jest proporcjonalny do natężenia światła wzbudzenia oraz do czasu trwania i liczby poszczególnych prób rejestracyjnych.
W niektórych eksperymentach możliwe jest przeprowadzenie ponad 50 prób pomiarowych w ciągu jednej lub dwóch godzin. Inne pomiary wymagają silniejszego pobudzenia, większej intensywności światła i dłuższego czasu rejestracji, a ze względu na uszkodzenia fotodynamiczne są ograniczone jedynie do kilku prób pomiarowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przeprowadzać obrazowanie napięcia z całej struktury aksonalnej i końcowej poszczególnych neuronów w skrawkach mózgu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje technikę obrazowania służącą do monitorowania zmian potencjału błonowego w neuronach z podmikrometrową rozdzielczością przestrzenną i podmilisekundową rozdzielczością czasową. Metoda ta wykorzystuje wzbudzanie laserowe barwników napięcioczułych do rejestracji sygnałów z różnych struktur neuronalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurofizjologia komórkowa
- Techniki obrazowania w neuronauce
- Monitorowanie potencjału błonowego
Wprowadzenie
- Zrozumienie potencjału błonowego jest kluczowe dla badania funkcji neuronów.
- Tradycyjne metody mogą nie zapewniać rozdzielczości przestrzennej i czasowej niezbędnej do szczegółowej analizy.
- Barwniki napięciowo-czułe umożliwiają optyczne śledzenie zmian potencjału błonowego.
- Układy obrazowania muszą być wystarczająco czułe, aby wykryć niewielkie zmiany natężenia światła.
Cel badania
- Monitorowanie integracji sygnałów potencjału błonowego w pojedynczych komórkach nerwowych.
- Uzyskanie obrazowania o wysokiej rozdzielczości z wielu obszarów neuronu.
- Badanie integracji sygnałów elektrycznych w aksonach, dendrytach i kolcach dendrytycznych.
Zastosowane metody
- Budowa układu obrazowania o wysokiej czułości.
- Wybór neuronów o anatomii odpowiedniej do efektywnego obrazowania.
- Obciążanie neuronów barwnikami napięciowo-wrażliwymi.
- Optyczne śledzenie zmian potencjału błonowego w strukturach neuronalnych.
Główne wyniki
- Technika ta umożliwia szczegółowe monitorowanie zmian potencjału błonowego.
- Wyniki wykazują możliwość obserwacji integracji sygnałów w poszczególnych komórkach nerwowych.
- Informacje pozyskuje się z aksonów, dendrytów oraz kolców dendrytycznych.
- Podejście to pozwala na lepsze zrozumienie przetwarzania informacji przez neurony.
Wnioski
- Opisana technika obrazowania dostarcza cennych informacji na temat funkcji neuronów.
- Umożliwia ona badanie integracji sygnałów elektrycznych z wysoką rozdzielczością.
- Metoda ta może przyczynić się do rozwoju badań w dziedzinie neurofizjologii komórkowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie za pomocą barwników napięciowo-czułych umożliwia monitorowanie dynamiki potencjału błonowego w poszczególnych przedziałach neuronalnych z rozdzielczością submikrometryczną i submilisekundową, co wypełnia krytyczną lukę w elektrofizjologii w badaniu integracji sygnałów w aksonach, dendrytach i kolcach. Możliwość ta wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w walidacji celów poprzez zapewnienie bezpośrednich, ilościowych odczytów elektrycznego zachowania neuronów w systemach istotnych dla danej choroby. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych, umożliwiając równoległe, wysokiej jakości rejestracje z wielu miejsc w obrębie pojedynczych neuronów, co dostarcza kluczowych informacji dla identyfikacji wiodących związków oraz strategii modulacji szlaków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określanie podprogowych i nadprogowych zdarzeń potencjału błonowego w aksonach, dendrytach i kolcach dendrytycznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia liniowe, niezależne od barwnika odczyty fluorescencyjne potencjału błonowego w pełnym zakresie fizjologicznym (-100 mV do +100 mV), co wspiera spójną ocenę stopnia oddziaływania na cel.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki odwracalnemu, niefarmakologicznemu wprowadzaniu barwnika (JPW 3028), który nie wykazuje wykrywalnego wpływu na funkcje neuronalne.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Generuje ilościowe sygnały optyczne z setek miejsc rejestracji na jeden neuron, co umożliwia wysokoprzepustową analizę propagacji i integracji sygnałów.
- Powtarzalność: Pozwala na stabilne rejestracje przez dłuższy czas (nawet do setek prób) przed wystąpieniem efektów fototoksycznych, co zapewnia spójność analizy.
- Skalowalność: Kompatybilność z wzbudzeniem laserowym i detekcją wielokamerową umożliwia równoległe monitorowanie przedziałów aksonalnych, dendrytycznych i kolców dendrytycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- System istotny dla choroby: Zastosowanie w przypadku skrawków mózgu z genetycznie znakowanymi neuronami (np. linie wykazujące ekspresję EGFP), co umożliwia badanie obwodów neuronalnych w modelach zaburzeń neurologicznych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez rejestrację dynamiki sygnałów w czasie rzeczywistym w kolcach dendrytycznych i aksonach — kluczowych miejscach plastyczności synaptycznej i dysfunkcji sieci.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez ilościowe określenie wpływu zaburzeń na integrację sygnałów w różnych przedziałach neuronalnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Technika ta integruje się z procesem odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu po badania przesiewowe w fazie przedklinicznej, w których wysokorozdzielcze obrazowanie potencjału błonowego wspiera weryfikację hipotez oraz ocenę związków wiodących w systemach neuronalnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez monitorowanie wstecznie propagujących potencjałów czynnościowych w dendrytach i aksonach, ujawniając mechanizmy sumowania i tłumienia sygnałów.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzację testów dzięki jednolitej kalibracji oświetlenia i minimalizacji szumów wibracyjnych, co jest kluczowe dla niezawodnych pomiarów optycznych.
- Analityka: Dostarcza ilościowych przebiegów intensywności fluorescencji odpowiadających przejściowym zmianom potencjału błonowego, co pozwala na bezpośrednie porównanie kształtów fal sygnału w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez rejestrację wzorców przesyłania sygnałów na poziomie kolców oraz aksonów, istotnych dla mechanizmów chorób neuropsychiatrycznych i neurodegeneracyjnych.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania do podłużnych badań funkcji neuronów w wielu paradygmatach eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez rejestrację sygnałów elektrycznych z struktur podkomórkowych (np. kolców dendrytycznych), które są niedostępne dla konwencjonalnych elektrod.
- Wartość operacyjna: Osiąga standaryzację dzięki zastosowaniu filtrów gęstości neutralnej, izolacji od wibracji oraz kontrolowanych protokołów dyfuzji barwników w celu zminimalizowania uszkodzeń fotodynamicznych i blaknięcia.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez zmniejszenie zależności od niskoprzepustowej elektrofizjologii w celu uzyskania danych o rozdzielczości podkomórkowej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie ilościowych efektów integracji sygnałów neuronalnych w zwalidowanych systemach istotnych dla danej choroby.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie obrazowania optycznego, elektrofizjologii patch-clamp oraz pracy z barwnikami napięciowo-czułymi.
- Zależność od laserowych źródeł światła, szybkich kamer CCD oraz stołów antywibracyjnych w celu uzyskania czułości poniżej milisekundy.
- Konieczność standaryzacji czasu barwienia, natężenia wzbudzenia i częstotliwości odświeżania klatek pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności wyników w różnych ośrodkach.
- Konieczność uwzględnienia adaptacji do różnych typów neuronów i obszarów mózgu, w oparciu o integralność anatomiczną oraz orientację wypustek względem powierzchni skrawka.
- Ograniczenie przez uszkodzenia fotodynamiczne przy wysokich natężeniach wzbudzenia i długotrwałym rejestrowaniu, co limituje liczbę prób w zależności od ekspozycji na światło i czasu trwania pomiaru.
