Symultaniczne rejestrowanie wewnątrzkomórkowe lędźwiowego motoneuronu oraz siły generowanej przez jego jednostkę motoryczną u dorosłej myszy in vivo

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie właściwości elektrofizjologicznych i kurczliwych pojedynczej jednostki motorycznej myszy poprzez wykonanie wewnątrzkomórkowych pomiarów neuronów ruchowych in vivo. Osiąga się to najpierw poprzez odsłonięcie rdzenia kręgowego i wybranego mięśnia. Następnie do ścięgna mięśnia mocuje się przetwornik siły.

Następnie stymulowany jest motoneuron za pomocą elektrody wewnątrzkomórkowej, co powoduje skurcz rejestrowanej jednostki motorycznej. Ostatecznie właściwości elektrofizjologiczne motoneuronu mogą zostać scharakteryzowane jednocześnie z właściwościami skurczowymi jego jednostki motorycznej. Demonstracja wizualna tej techniki jest kluczowa, ponieważ etapy mikrochirurgiczne są bardzo trudne do opanowania ze względu na niewielki rozmiar zwierzęcia.

Aby rozpocząć procedurę, należy znieczulić mysz, wstrzykując dootrzewnowo pentobarbital sodu lub mieszaninę ketaminy i ksylazyny. Należy upewnić się, że u myszy nie występuje odruch ucisku palca. Następnie, za pomocą tępych nożyczek, należy wykonać nacięcie nad tchawicą i odsunąć skórę na obie strony.

Następnie rozdziel śliniankę za pomocą pęsety tępej. Aby odsłonić dwa cienkie mięśnie pokrywające tchawicę, rozdziel oba mięśnie, by ukazać tchawicę. Użyj do tego pęsety Dumont nr 7.

Przesuń dwie nici szwu jedwabnego 4-0 pod tchawicę. Następnie wykonaj poprzeczne cięcie w tchawicy pomiędzy dwiema pierscieniami chrzęstnymi. Należy jednak uważać, aby nie przeciąć tchawicy całkowicie.

Następnie wprowadź rurkę intubacyjną do tchawicy. Zabezpiecz obie strony otworu wprowadzenia, zawiązując nad nim szwy. Po tym czasie podłącz rurkę intubacyjną do respiratora dla myszy oraz kapnografu.

Następnie podłącz respirator do czystego tlenu za pomocą worka amortyzującego. Dostosuj parametry respiratora w taki sposób, aby mysz nie walczyła z wentylacją mechaniczną, a ciśnienie parcjalne dwutlenku węgla w powietrzu wydychanym było stabilne na poziomie od 4% do 5%. W tym kroku odsłoń żyłę szyjną po jednej stronie szyi, stosując technikę tępej dyssekcji.

Żyła szyjna dzieli się na dwa główne pnie: żyłę twarzową przednią i tylną. Ostrożnie oddziel żyłę od otaczającej ją tkanki łącznej. Następnie przesuń pod żyłą dwie nici jedwabne do szwów o rozmiarze 6 i rozsuń je tak daleko, jak to możliwe, wzdłuż długości żyły.

Następnie załóż mały klips naczyniowy na bliższym odcinku żyły i podwiąż jej odcinek dalszy. Używając bardzo cienkich nożyczek irydowych, wykonaj małe nacięcie poprzeczne w żyle. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie przeciąć żyły całkowicie.

Następnie wprowadź wypełniony cewnik French do otworu, aż do klipsa naczyniowego utrzymującego żyłę i cewnik razem. Ostrożnie usuń klips naczyniowy. Następnie wsuń cewnik o kilka milimetrów głębiej do żyły. Zabezpiecz cewnik, wiążąc go szwami po obu stronach miejsca wprowadzenia.

Następnie należy połączyć jeden z cewników ze strzykawką lub pompą strzykawkową w celu podawania uzupełniających dawek środków znieczulających, takich jak pentobarbital sodu lub ketamina z ksylazyną. Powtórz procedurę dla kolejnej żyły i podłącz drugi cewnik do pompy strzykawkowej w celu powolnej infuzji dożylnej 4% roztworu glukozy zawierającego 1% wodorowęglanu sodu i 14% plasmonu. Na koniec zamknij skórę w okolicy karku za pomocą igły i szwy.

Następnie ułóż mysz z powrotem w pozycji brzusznej. Wykonaj nacięcie od górnej części uda do ścięgna Achillesa. Oddziel skórę od leżących pod nią mięśni, uważając, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych.

Następnie zidentyfikuj przednią krawędź mięśnia dwugłowego uda, która widoczna jest jako biała linia biegnąca w dół uda. Następnie ostrożnie rozetnij wzdłuż tej linii od kolana aż do kości biodrowej. Rozdziel mięśnie, aby odsłonić nerw kulszowy znajdujący się pod mięśniem dwugłowym uda.

Ostrożnie wypreparuj mięsień dwugłowy uda i usuń go. Aby odsłonić nerw kutyczowy i mięśnie trójgłowe łydki, zidentyfikuj nerw piszczelowy pomiędzy nerwem strzałkowym wspólnym a nerwem skórnym piszczelowym. spośród różnych gałęzi nerwu piszczelowego, odróżnij gałęzie unerwiające mięsień trójgłowy łydki od gałęzi biegnących głębiej.

Używając nici jedwabnej OTT o grubości ośmiu, zwiąż wszystkie gałęzie nerwu piszczelowego, pozostawiając nienaruszone gałęzie unerwiające mięsień trójgłowy łydki. Przetnij nerw piszczelowy w jak największej odległości od węzła. Zidentyfikuj kręgi T13 i L1, przy czym T13 jest ostatnim kręgiem, do którego przytwierdzone są żebra.

Następnie unieruchom kręgosłup za pomocą zacisków kręgowych do rdzenia kręgowego Cunninghama po obu stronach T 13 i L 1. Należy uważać, aby nie uciskać rdzenia kręgowego, lecz przyłożyć niewielkie napięcie wzdłuż osi podłużnej. Upewnij się, że kolumna kręgosłupowa jest dobrze zabezpieczona, delikatnie dociskając ją pęsetą.

Używając precyzyjnych kleszczy R, usuń wyrostki kolczyste, a następnie blaszki łukowate na poziomie T13 i L1, aby odsłonić rdzeń kręgowy. Następnie umieść wykonaną na zamówienie plastikową wannę, aby otoczyć rdzeń kręgowy. Po tym zabezpiecz wannę w miejscu za pomocą nici jedwabnej o grubości 4-0.

Na koniec należy upewnić się, że kąpiel jest wodoszczelna, uszczelniając ją szybkoschnącym uszczelniaczem odlewniczym. Po wyschnięciu uszczelniania należy usunąć watę pokrywającą rdzeń kręgowy i napełnić kąpiel olejem mineralnym. Użyj kolejnego zacisku kręgowego, aby zacisnąć wyrostek kolczysty w odcinku krzyżowym.

Aby ustabilizować tylną część ciała zwierzęcia, należy użyć trzeciego zacisku do unieruchomienia prawej kończyny tylnej i stawu skokowego, zginając kolano oraz staw skokowy pod kątem 90 stopni. Usunąć gazę pokrywającą obszar kończyny tylnej. Wydzielić ścięgno Achillesa z otaczających go tkanek.

Od kesin triceps od otaczających tkanek w możliwie największym stopniu, używając igły z nicią. Przewlecz nić jedwabną o rozmiarze 6-0 przez ścięgno Achillesa i zawiąż potrójny węzeł wokół ścięgna. Następnie umieść przetwornik siły blisko węzła.

Następnie przymocuj ścięgno do przetwornika siły za pomocą jedwabnej nici i odetnij dystalną część ścięgna. W dalszej kolejności wprowadź dwa druty ze stali nierdzewnej pod powięź mięśni triceps surae. Druty te są podłączone do pozakomórkowego wzmacniacza prądu zmiennego (AC).

W celu rejestracji EMG umieść nerw trójgłowy łydki na katodzie elektrody hakowej, tak aby anoda dotykała pobliskiego mięśnia. Następnie stymuluj nerw trójgłowy łydki za pomocą prostokątnego impulsu o czasie trwania 50 µs i rosnącym natężeniu przy niskiej częstotliwości, aż do zaobserwowania maksymalnej amplitudy skurczu. Następnie stymuluj nerw trójgłowy łydki za pomocą prostokątnego impulsu o czasie trwania 50 µs i rosnącym natężeniu przy niskiej częstotliwości, aż do zaobserwowania maksymalnej amplitudy skurczu.

Rysunki te pokazują, jak zidentyfikować motoneuron z grupy mięśnia trójgłowowego ramienia. Po penetracji, przy niskiej intensywności stymulacji można zaobserwować jedynie monosynaptyczny EPSP przy wyższej intensywności. EPSP może być wystarczająco duży, aby wywołać ortotropowy potencjał czynnościowy przy jeszcze wyższej intensywności stymulacji, zgodnie z prawem „wszystko albo nic”.

Kolcem antydromicznym charakteryzuje się krótsza latencja niż w przypadku monosynaptycznego EPSP. Jeśli przez mikroelektrodę zostanie wprowadzony prąd o natężeniu wystarczającym do wywołania kolca, w mięśniu można zarejestrować aktywność EMG po krótkim opóźnieniu, po której następuje skurcz mięśnia.

Po zidentyfikowaniu neuronu ruchowego można scharakteryzować jego właściwości elektrofizjologiczne. Na przykład niniejszy rysunek ilustruje, w jaki sposób można zmierzyć oporność wejściową, stosując hiperpolaryzujące i depolarzyzujące impulsy prądu oraz wykreślając zmiany potencjału błonowego w funkcji ilości wstrzykniętego prądu. Właściwości skurczowe jednostki motorycznej można również badać, stosując różne protokoły stymulacji.

Na przykład zależność siły od częstotliwości można uzyskać poprzez wstrzykiwanie krótkich impulsów prądu z różną częstotliwością do neuronu ruchowego. Następnie można wykreślić siłę w stanie stacjonarnym w funkcji częstotliwości impulsów prądowych, co pozwoli uzyskać sygmoidalną krzywą zależność siły od częstotliwości. Po opanowaniu techniki chirurgicznej, część tej procedury może zostać wykonana w ciągu trzech godzin, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia wszystkich czynności.