Ilościowy pomiar odpowiedzi immunologicznej i snu u Drosophila

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena snu oraz funkcji odpornościowej u muszki owocówki drosophila. W pierwszym etapie osiąga się to poprzez rejestrację aktywności lokomotorycznej zainfekowanych much w celu pomiaru snu, a w drugim kroku, po infekcji, muchy są homogenizowane, rozcieńczane i wysiewane na płytki z agarem LB. Liczba wyrosłych jednostek tworzących kolonie wskazuje na zdolność much do eliminacji infekcji.

Następnie zainfekowane muchy wykazujące ekspresję transgenu zawierającego reporter lukcyferazy NF kappa b przenosi się na płytkę 96-dołkową zawierającą lucyferynę, która jest substratem lukcyferazy. Pomiar aktywności lukcyferazy kappa b w czasie rzeczywistym wskazuje na aktywację szlaku sygnalizacyjnego NF kappa B podczas infekcji, co łącznie wpływa na przeżywalność w trakcie snu. Eliminacja bakterii oraz aktywność reportera NF KB są pomiarami dostarczającymi wglądu mechanistycznego w molekularny związek między funkcją odpornościową a zachowaniem.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ opanowanie spójności w ręcznym zakażaniu much wymaga czasu i praktyki. Główną zaletą opisanej techniki lucyferazowej w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak QPCR, jest możliwość ciągłego pomiaru aktywności NF Kappa B w czasie rzeczywistym w żywych muchach. Należy rozpocząć od inkubacji kultur drosophila w późnym stadium poczwarki przez trzy do czterech dni, aby osobniki dorosłe zaadaptowały się do warunków środowiskowych.

W tym miejscu muchy umieszcza się pod stałym oświetleniem, aby wyeliminować wpływ zegara okołodobowego na odpowiedź immunologiczną i zachowanie. Następnie do monitorów aktywności przenosi się muchy w wieku od jednego do czterech dni. Monitory rejestrują ich aktywność przez minimum trzy dni przed infekcją, w tym jeden dzień bezpośrednio poprzedzający planowane zakażenie.

Za pomocą sterylnej końcówki pipety pobierz pojedynczą kolonię z płytki SIA i zanurz końcówkę w probówce zawierającej pięć mililitrów pożywki LB, aby zweryfikować poprawność techniki sterylnej. Należy pamiętać o przygotowaniu kontrolnej hodowli pozorowanej bez bakterii. Inkubuj bakterie przez noc, aż następnego dnia osiągną fazę wzrostu wykładniczego.

Zmierz absorbancję hodowli przy 600 nanometrach. Jako próbę ślepą wykorzystaj drugą kulturę Q vet. Hodowla jest gotowa, gdy stężenie wynosi od 0,5 do 1 jednostki absorbancji; w przeciwnym razie przedłuż czas inkubacji w razie potrzeby.

Teraz należy przygotować roztwór bakteryjny do zakażenia much. Rozcieńcz bakterie w PBS do oczekiwanej absorbancji 0,1 przy 600 nanometrach. Następnie dodaj barwnik spożywczy jako kontrolę wstrzyknięcia.

Wypłucz bakterie pożywką LB. Przechowuj oba roztwory w lodzie. Następnie, używając wyciągacza do mikropipet, wykonaj igły wstrzykujące z cienką końcówką pod mikroskopem stereoskopowym.

Użyj precyzyjnej pęsety, aby odłamać końcówkę każdej igły w taki sposób, aby otwór był wystarczająco duży, by umożliwić zasysanie płynu do wstrzyknięcia, a jednocześnie na tyle mały, aby zminimalizować obrażenia muchy. Przymocuj szklaną igłę do plastikowej strzykawki o pojemności 3 cc za pomocą odcinka rurki. Przepływ medium wstrzykiwanego jest kontrolowany ręcznie.

Należy unikać zanieczyszczenia gumowego wężyka płynem do iniekcji, ponieważ aparat ze strzykawką jest używany zarówno do iniekcji zakaźnych, jak i kontrolnych. Przepływ medium do iniekcji należy zweryfikować za pomocą chusteczki Kimwipe. Dwiema kluczowymi kwestiami dla powodzenia iniekcji są zastosowanie optymalnego rozmiaru igły oraz szczelne połączenie między igłą a strzykawką.

Po pełnym przygotowaniu systemu do iniekcji, znieczulone muchy przy użyciu minimalnego przepływu dwutlenku węgla; postępuj sprawnie, aby żadna z much nie była znieczulona dłużej niż pięć minut. Następnie wykonaj iniekcję, wprowadzając szklaną igłę w obszar nad sklerytami grzbietnej części klatki piersiowej. Przenikanie medium iniekcyjnego do organizmu muchy jest potwierdzane przez barwnik spożywczy, który staje się widoczny w miarę rozprzestrzeniania się wstrzykniętego roztworu.

Przed rozpoczęciem należy upewnić się, że wszystkie materiały wykorzystywane w tej procedurze zostały poddane autoklawowaniu co najmniej dzień wcześniej. Przygotować szalki Petriego o średnicy 10 cm z pożywką agarową LV. W dniu eksperymentu znieczulić muchy i umieścić je w probówkach do wirowania o pojemności 1,5 ml.

Przygotuj co najmniej dwie grupy po 10 much każda dla każdego warunku eksperymentalnego. Przygotuj również grupę kontrolną much niezakażonych, szczególnie w przypadku użycia szczepu bakteryjnego bez oporności na antybiotyki. Wszystkie napełnione probówki przechowuj w lodzie.

Następnie do każdej probówki z muchami należy dodać 400 µL pożywki LB. Muchy należy zhomogenizować za pomocą małego pestika, wykonując tę czynność w pobliżu płomienia, aby zapobiec kontaminacji. Teraz, używając przyciętych końcówek pipet, należy wykonać seryjne rozcieńczenia homogenatu w stosunku 1:10 w objętościach 200 µL.

Jeśli homogenat zostanie przygotowany bezpośrednio po infekcji sia, należy wykonać rozcieńczenia do 1:1000, natomiast w przypadku homogenatu pobranego 24 godziny po infekcji, należy wykonać rozcieńczenia do 1:100 000. Następnie należy zasiać dwa największe rozcieńczenia na płytkach 10 cm, używając szklanych kulek w celu zapewnienia równomiernego rozkładu, a następnie inkubować płytki przez noc. Następnego dnia należy policzyć liczbę kolonii na płytce poprzez bezpośrednią obserwację lub za pomocą oprogramowania do liczenia kolonii.

Następnie oblicz liczbę jednostek tworzących kolonie na jedną muchę. W tym badaniu wykorzystuje się w odpowiednim czasie muchy transgeniczne niosące reporter lukcyferazy kappa b. Badanie wymaga również hodowli bakterii, takich jak SCIA, przygotowanych do wstrzyknięcia zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji.

Zaadaptuj muchy do eksperymentalnych warunków oświetlenia. W tym przykładzie muchy kappa b luciferase w wieku od jednego do czterech dni są utrzymywane w fiolkach zawierających pożywkę złożoną z 5% sacharozy i 2% agaru, a następnie umieszczone w stałym świetle przez dwa dni. Następnie przygotuj mikropłytkę 96-dołkową dla much.

Napełnij każde wgłębienie dwiema warstwami pożywki. Najpierw warstwą średnią, dodając do każdego wgłębienia 300 µL roztworu 5% sacharozy i 2% agaru. Przykryj płytkę gęstą tkaniną z siatki i pozostaw do całkowitego wyschnięcia na maksymalnie jedną godzinę.

Następnie do każdej studzienki dodaj 50 µL warstwy wierzchniej zawierającej 5% sacharozy, 1% agaru oraz 2 mM Lucifera. Ze względu na światłoczułość Lucifera, pozwól płytce wyschnąć w ciemności i w dalszej części procedury ogranicz ekspozycję płytki na światło.

Po ostygnięciu agaru przykryć płytkę przezroczystą folią samoprzylepną. Następnie za pomocą cienkiej igły wykonać dwa otwory w folii nad każdą dołkiem. Otwory te umożliwiają wymianę powietrza oraz znieczulenie gazowe.

Następnie, aby ułatwić wprowadzanie much, należy za pomocą ostrego ostrza i linijki wykonać nacięcia pomiędzy poszczególnymi kolumnami. Muchy należy znieczulić dwutlenkiem węgla i przenosić pojedynczo do każdego dołka, kolumna po kolumnie. Jeśli mucha przyklei się do folii, należy dać jej możliwość samodzielnego uwolnienia się przed interwencją.

Wróć płytkę z mikrowydziałami do inkubatora z ciągłym oświetleniem na okres od ośmiu do 24 godzin. W celu znieczulenia much uwięzionych w wydziale, użyj końcówki mikropipety podłączonej do linii z dwutlenkiem węgla o niskim ciśnieniu. Upewnij się, że gaz znajduje się pod bezpiecznie niskim ciśnieniem, i umieść końcówkę mikropipety bezpośrednio nad otworami wentylacyjnymi, aby znieczulać muchy indywidualnie w grupach po osiem.

Przenieś każdą muchę na podkładkę z CO2 i zainfekuj je bakteriami jak poprzednio. Następnie zwróć każdą muchę do pierwotnej studzienki i ponownie zamknij mikropłytkę. Zmierz luminescencję każdej muchy za pomocą luminometru znajdującego się w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze, zgodnie z określonym harmonogramem oświetlenia.

Włóż płytki do kasety ładującej, upewniając się, że płytki zawierające muchy znajdują się pomiędzy czystymi, pustymi płytkami. Zaprogramuj luminometr zgodnie ze specyfikacją producenta i dokonuj pomiarów co godzinę przez minimum 24 godziny. W tym przykładzie detektory zostały zaprogramowane tak, aby odczytywać każdą studzienkę przez 10 sekund.

Po zakończeniu eksportuj pliki danych do arkusza kalkulacyjnego i przeprowadź standardową analizę, przedstawiając wyniki na wykresach. Można przeanalizować przykładowe dane. Średnia liczba zliczeń na sekundę została obliczona z trzech pomiarów na każdą studzienkę.

Muszki typu dzikiego Canton S oraz muszki mutanty relish. E 20 z brakującym genem NF kappa B umieszczono w dwóch monitorach aktywności w stałym świetle i zainfekowano sia. W tym przykładzie infekcja stymulowała sen.

Wyraźnie stwierdzono, że mutanty relish E 20 wykazywały krótszy czas snu po infekcji niż muchy kontrolne Canton s. Zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami, mutanty relish E 20 szybciej ulegały infekcji w porównaniu z muchami typu dzikiego.

Większość much przeżyła wstrzyknięcie w grupie kontrolnej aseptycznej, co wskazuje, że muchy padły w wyniku infekcji, a nie z powodu urazu powstałego podczas wstrzyknięcia. Ze względu na to, że mutanty relish ginęły bardzo szybko, do wykazania ilości bakterii po infekcji wykorzystano wyłącznie muchy szczepu Canton S. Sia nadal namnażała się w organizmie muchy 24 godziny po infekcji.

Aktywność reportera lucyferazy wykazała duże zróżnicowanie między poszczególnymi muchami oraz między poszczególnymi punktami danych. Chociaż sygnał pochodzi ze wszystkich tkanek w organizmie muchy, nie oczekuje się, że każda tkanka będzie emitować taką samą ilość sygnału, a widoczność tkanki dla detektora zmienia się wraz z ruchem muchy. W tym przykładzie muchy zostały zainfekowane i porównane z grupą kontrolną poddaną odpowiednim zabiegom.

Muchy, które padły, zostały wykluczone z analizy w obrębie grupy. Aktywność reportera lucyferazy Kappa b stale rośnie po infekcji. Aktywność reportera lucyferazy Kappa b rosła również stale po urazie aseptycznym.

Szczytowa aktywność wystąpiła około 12 godziny zarówno po urazie, jak i po infekcji. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak ilościowo oceniać funkcję immunologiczną i sen u SSO po infekcji. Możemy mierzyć sen, przeżywalność, czas, eliminację bakterii oraz aktywność w czasie rzeczywistym raportera transkrypcyjnego un copy.