Wytwarzanie i zastosowanie wielokanałowych elektrod typu „piggy-back” do farmakologicznych manipulacji odpowiedziami neuronalnymi in vivo

Celem niniejszej procedury jest jonoforetyczna aplikacja środków farmakologicznych do mikroobwodów w mózgu przy jednoczesnym rejestrowaniu aktywności neuronalnej. Najpierw wyciągnij jednokanałową elektrodę szklaną do rejestracji pojedynczych komórek i zagnij jej końcówkę. Następnie wyciągnij wielokanałową elektrodę szklaną i odłam jej końcówkę do pożądanej średnicy.

Przejdź do montażu obu elektrod. Ostatecznie otrzymana elektroda jest wykorzystywana do pozakomórkowych rejestracji in vivo, podczas których na żądanie można stosować środki farmakologiczne w celu manipulacji mikroobwodami neuronalnymi. Dzień dobry, nazywam się dr Achim Klu i nasze laboratorium pokaże Państwu dzisiaj, jak wykonać wielokanałowe elektrody typu piggyback.

Elektrody te mogą być wykorzystywane do wprowadzania jonoforowych agonistów i antagonistów neuronalnych do mikrośrodowiska neuronu, a tym samym do manipulowania obwodami neuronalnymi neuronu in vivo. Dzień dobry, jestem dr An Zillow. Pracuję jako stażysta podoktorski w laboratorium dr. Ah him Crow i dzisiaj zaprezentuję tę procedurę. W przypadku elektrody jednokanałowej należy użyć szklanej kapilary jednokanałowej z włóknem i wyciągnąć końcówkę do średnicy około 1–2 µm oraz długości trzonu od 10 do 12 mm.

Okresowo weryfikuj rezystancję wyciągniętych elektrod, napełniając je trzymolowym roztworem chlorku sodu i testując je za pomocą standardowego miernika O w 0,9% soli fizjologicznej. Po napełnieniu elektrody roztworem soli, wysycha on szybko, co czyni elektrodę bezużyteczną. Dlatego należy przeprowadzać wyłącznie takie testowanie.

Odmierz elektrody, które nie będą wykorzystywane do produkcji typu piggyback. Aby stworzyć pełną elektrodę wielokanałową, wyciągnij szkło do uzyskania końcówki pipety o całkowitej średnicy około 10 µm lub mniejszej. Elektroda z prawidłowo wyciągniętą końcówką ma kluczowe znaczenie dla powodzenia procedury.

Oprócz tego, że końcówka musi być długa i cienka, powinna być jednocześnie sztywna i łatwa do przełamania do pożąnej średnicy. Przełamanie końcówki do właściwej średnicy nastąpi w kolejnym kroku. Zatem dokładny rozmiar końcówki jest mniej istotny podczas procesu łączenia niż ogólny kształt końcówki elektrody, która powinna być długa i stosunkowo cienka.

Następnie trzymając elektrodę jednokanałową pod kątem około 45 stopni, z końcówką skierowaną w dół, przesuń ją stosunkowo szybko przez płomień. Dąż do tego, aby płomień stopił szkło w obszarze przejścia, około 10 mm od końcówki elektrody, w celu wygięcia jej o około 20 stopni. Umieść elektrodę wielokanałową w masie z plasteliny na szkiełku przedmiotowym, a następnie wprowadź ją do stolika mikroskopu.

Uchwyt do szkiełek Przedmiotowych Korzystając z manipulatorów XY stolika mikroskopu, ostrożnie przesuń końcówkę elektrody w stronę elementu z pleksiglasu. Obserwuj przełamanie końcówki przez okulary mikroskopu. Tutaj przedstawiono konfigurację zestawu elektrody.

Elektroda wielokanałowa jest zamocowana na szkiełku przedmiotowym na stole mikroskopu. Elektroda jednokanałowa jest natomiast utrzymywana przez ręczny manipulator wieloosiowy, który umożliwia precyzyjne opuszczenie pipety jednokanałowej na pipetę wielokanałową. Opuszczamy elektrodę jednokanałową bezpośrednio w zagłębienie elektrody wielokanałowej, utworzone przez układ pięciu kanałów, tak aby jej końcówka wystawała poza końcówkę elektrody wielokanałowej o około 5 do 10 µm.

Sklej trzpienie obu elektrod za pomocą cyjanoakrylanu. Rozpocznij od miejsca najbardziej oddalonego od końcówek i powoli przesuwaj wykałaczkę z kroplą kleju wzdłuż trzpieni elektrod w kierunku ich końcówek. Nałożenie kleju zbyt blisko końcówek elektrod spowoduje ich zapchanie i sprawi, że elektroda stanie się co najmniej częściowo niefunkcjonalna.

Wymieszać niewielką ilość cementu dentystycznego. Pozostawić do wyschnięcia przez około 15 minut. Następnie ostrożnie wyjęć gotową elektrodę typu piggyback.

Najpierw odłącz od uchwytu mikromanipulatora, a następnie od szkiełka przedmiotowego. Tuż przed użyciem elektrody przygotuj do wstecznego napełnienia każdej kapilary odpowiednim lekiem. Napełnij cztery zewnętrzne kapilary w konfiguracji pięciokapilarnej czterema wybranymi lekami, a kapilarę środkową 3 M NaCl jako kapilarę równoważącą.

Następnie napełnij elektrodę do rejestracji z jedną kanapką (single barrel) trzymolowym roztworem chlorku sodu. Teraz włącz moduły pompy do jonoforezy i przetestuj wszystkie kanały. Funkcja testowania elektrod w każdym module pompy pomoże określić, czy kanał elektrody jest sprawny do rejestracji z głębokich obszarów mózgu.

Gotowa elektroda pięciokanałowa zmontowana z pojedynczą elektrodą rejestrującą posiada długi trzpień o długości około siedmiu milimetrów. W jonteforezie powszechnie stosuje się kilka agonistów i antagonistów synaptycznych w celu blokowania inhibicji glicynowej za pomocą leków takich jak antagoniści receptorów glicynowych. Strychnina w formie hydroponianu zazwyczaj zwiększa częstotliwość wyładowań w neuronach.

Te przykładowe dane mierzą funkcję częstotliwości wyładowań neuronów słuchowych w zależności od natężenia i pokazują odpowiedzi na sinusoidalne bodźce dźwiękowe o rosnącym natężeniu dostarczane do uszu zwierzęcia. Głośniejsze dźwięki skutkowały wyższymi częstotliwościami impulsów przed zastosowaniem ścisłego progu. Funkcja natężenia częstotliwości neuronów wykazuje niskie częstotliwości impulsów.

Przyłożenie początkowego prądu jontoforetycznego o natężeniu 15 nA stymuluje niewielki wzrost prądu wyrzutowego. Stopniowo wyższe natężenia prądu wyrzutowego blokują coraz więcej receptorów glicynowych w neuronie, co prowadzi do progresywnego zwiększenia częstotliwości wyładowań. Przy prądzie 45 nA wszystkie receptory glicynowe w tym neuronie wydają się być zablokowane przez chlorowodorek strikniny.

Dalszy wzrost prądu wyrzutu oraz uwalnianie jeszcze większej ilości substancji nie spowodowało kolejnych zmian. Funkcja poziomu częstotliwości wyładowań neuronów po zakończeniu jontoforezy wykazuje pełny powrót odpowiedzi neuronalnych do poziomu bazowego po około 25 minutach. Proces ten zależy od rodzaju i ilości wyrzuconego leku.

Należy pamiętać, że lek podawany w ten sposób będzie dyfundował w okolice miejsca rejestracji i może również blokować receptory w sąsiednich neuronach. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak połączyć elektrodę rejestrującą z wielokanałową elektrodą do podawania leków, aby uzyskać niskoszumne rejestracje z głębokich struktur mózgu, wraz z czasowo kontrolowanym podawaniem do czterech czynników farmakologicznych.