Cytometria masowa: Protokół codziennego strojenia i analizy próbek komórek na cytometrze masowym CyTOF

Głównym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie prawidłowego codziennego strojenia oraz analizy próbek na instrumencie CyTOF. W pierwszej kolejności urządzenie zostaje złożone i włączone. Następnie ustawienia instrumentu są optymalizowane w celu dostrojenia go do maksymalnego sygnału.

Urządzenie jest następnie gotowe do analizy próbek. W ostatnim kroku urządzenie zostaje oczyszczone i wyłączone. W efekcie można uzyskać optymalne dane komórkowe zgodnie ze specyficznymi wymaganiami czasowymi.

Wizualna demonstracja tej techniki jest kluczowa. Codzienne procedury konfiguracji, strojenia i czyszczenia są trudne do opanowania na podstawie instrukcji, ponieważ obejmują one wiele równoległych kroków w oprogramowaniu.

Należy zdobyć doświadczenie, aby wyrobić sobie wyczucie odpowiednich poziomów tła i intensywności sygnału. Przynajmniej 15 minut przed rozpoczęciem eksperymentu należy uruchomić program oprogramowania CyTOF i wybrać konfigurację instrumentu. Następnie w zakładce koszyka kart należy kliknąć przycisk grzejnika, aby płaszcz komory rozpylającej osiągnął 200 °C.

Wymień strzykawkę w pompie strzykawkowej na nową strzykawkę wypełnioną wodą milli cube. Następnie oczyść nebulizator, wykonując dwukrotne płukanie wsteczne 5% roztworem Citron przez każdy port. Aby usunąć pozostałości Citronu, powtórz płukanie wsteczne wodą Milli Q.

Następnie otwórz zawór butli z argonem, co spowoduje zapalenie się kontrolki argonu na przednim panelu urządzenia. Następnie podłącz nebulizator do wlotu gazu pomocniczego oraz do rurki doprowadzającej ciecz. Wsuń końcówkę nebulizatora do białego otworu w płaszczu grzejnym w zakładce kontrolera RFG w oknie konfiguracji instrumentu.

Kliknij start plasma, a następnie kliknij okay. Po zakończeniu uruchamiania ponownie kliknij okay w oknie wyskakującym. Teraz włącz pompę strzykawkową.

Podczas ponownego napełniania strzykawki należy nacisnąć przycisk stop zamiast przycisku pause, aby zresetować licznik objętości. Przed kalibracją cytometru masowego należy upewnić się, że urządzenie nagrzewało się przez 20 minut. Po ustabilizowaniu pracy maszyny kliknij przycisk ustawień akwizycji, aby otworzyć okno ustawień pozyskiwania danych. W zakładce anality.

Kliknij tablicę okresową, aby otworzyć panel wyboru izotopów. Następnie wybierz izotopy zawarte w roztworze strojącym DVS sciences wymienione w instrukcji i kliknij zapisz. Następnie kliknij przycisk izotopów na odczyt, aby otworzyć okno mas na odczyt.

Wybierz liczbę impulsów i przeskaluj oś y, wpisując nową wartość, a następnie naciskając enter. Teraz napełnij zieloną strzykawkę norm-inject o objętości 1 mL roztworem strojącym. Przekręć przełącznik portu próbkowego do pozycji load.

Wstrzyknij 450 µL roztworu strojącego, a następnie przekręć selektor w pozycję wstrzykiwania. Czekaj, aż izotopy roztworu strojącego zaczną pojawiać się w postaci smug na tym wyświetlaczu. Sygnały w regionie czasu przelotu od 9 400 do 9 800 wynikają z obecności izotopów ksenonu w gazie argonowym.

Powróć teraz do widoku mas w oknie odczytu i kliknij zielony przycisk odtwarzania. Każda kolorowa linia reprezentuje wybrane izotopy z karty analitów. Gdy poziomy izotopów ustabilizują się, dostrój prąd wybiórczy z menu rozwijanego w karcie parametrów okna ustawień akwizycji danych.

W oknie startowym wprowadź zero dla wartości początkowej oraz 10 dla wartości końcowej. Jako wartość kroku wprowadź 0,5, a dla czasu ustalania wprowadź 200. Następnie kliknij zapisz.

Następnie kliknij ponownie w oknie mas na odczyt i naciśnij przycisk odtwarzania. Po odnotowaniu wartości szczytów sygnałów izotopów, przejdź do karty konfiguracji kanałów DAC w oknie konfiguracji instrumentu. Przewiń w dół do sekcji prądu i wprowadź wartość szczytu izotopu.

Kliknij „set actual current value”, a następnie zapisz zmiany. Następnie zmień wartość w menu rozwijanym na „make up gas”. W oknie startowym wprowadź 0,55, w oknie końcowym 0,95, w oknie wartości kroku 0,05, a w oknie czasu stabilizacji 200.

Kliknij zapisz. Po powrocie do okna mas na odczyt i ponownym kliknięciu odtwórz, oś x będzie teraz wyświetlać natężenie przepływu gazu uzupełniającego. Zwróć uwagę na wartości, przy których sygnały izotopów osiągają szczyt, i zaobserwuj gwałtowny wzrost sygnału GD 1 55 pod koniec.

Następnie powróć do karty konfiguracji kanału DAC. Przewiń w dół do sekcji makeup gas i wprowadź nową wartość piku izotopowego. Kliknij przycisk set actual current value.

Następnie ponownie kliknij zapisz, aby zarejestrować stosunek pożądanego izotopu do tlenku. Najpierw wykonaj drugą iniekcję 450 µL roztworu strojącego. Następnie w zakładce parametrów wybierz czas z menu rozwijanego i wprowadź zero w oknie startu, 10 w oknie końca, jeden w oknie wartości kroku oraz 200 w oknie stabilizacji.

Po kliknięciu przycisku odtwarzania w oknie mas na odczyt, należy za pomocą kursora odczytać wyższą wartość dla TM 1 69 lub TB 1 59, a także wartość GD 1 55. Następnie należy wstrzyknąć 3 mL wody Milli Q przez pętlę próbkową, a następnie 500 µL roztworu płuczącego DVS. W zakładce kalibracji masy należy kliknąć uruchom, aby monitorować postęp płukania czyszczącego, aż intensywność smug zacznie spadać.

Następnie należy dodać 3 mL wody z milli cube i monitorować proces do czasu, aż poziomy smug spadną do wartości tła. Rozpocznij od wprowadzenia izotopów próbki, które zostały właśnie zaprezentowane, w miejsce izotopów roztworu strojącego, a następnie kliknij zapisz. Następnie otwórz okno akwizycji i zmień ustawienia akwizycji w zależności od objętości próbki.

Na przykład próbka o objętości 450 µL wypełni pętlę próbkowania, a czas analizy wyniesie 600 s, aby uwzględnić opóźnienia w akwizycji danych komórkowych. Przed uruchomieniem należy ustawić opóźnienie akwizycji na co najmniej 30 s oraz opóźnienie stabilizacji detektora na co najmniej 20 s. Próbki komórkowe należy przemyć co najmniej dwukrotnie wodą z systemu Milli-Q, a następnie resuspender próbkę do maksymalnego stężenia 10⁶ komórek/ml i przefiltrować otrzymany roztwór komórkowy przez sitko komórkowe o oczkach 35 µm.

Aby usunąć wszelkie agregaty. Teraz wprowadź nową nazwę pliku dla aktualnej próbki. Należy pamiętać, że wszystkie pliki muszą zostać zapisane na dysku E.

Następnie przełącz zawór pętli próbkowej w pozycję załadunku, wstrzyknij próbkę, przełącz zawór pętli próbkowej z powrotem w pozycję wtrysku, a następnie kliknij uruchom. W oknie akwizycji komórki będą reprezentowane w oknie migawki jako poziome skupiska znaczników w każdym pionowym kanale izotopowym i wykażą najlepszą rozdzielczość przy prędkości od 300 do 500 komórek na sekundę, jak pokazano tutaj.

Po zakończeniu akwizycji danych z próbki pojawi się okno wyskakujące. Kliknij OK, aby potwierdzić zakończenie analizy próbki, a następnie wstrzyknij co najmniej 500 µL wody MQ pomiędzy każdą próbką, aby zminimalizować efekt przenoszenia próbki i oczyścić urządzenie. Po zakończeniu pracy wstrzyknij 450 µL roztworu płuczącego do pętli próbkowania. Monitoruj uwalnianie wolnego metalu, a następnie przepłucz pętlę próbkowania trzema mililitrami wody milli Q, monitorując płukanie aż do osiągnięcia poziomów tła dla linii bazowej.

Aby wyłączyć urządzenie, wybierz kartę kontrolera RFG w oknie konfiguracji instrumentu i kliknij stop plasma. Po zakończeniu procedury kliknij okay w oknie wyskakującym, w którym zaleca się usunięcie nebulizatora w karcie card cage. Wyłącz grzałkę, zamknij zawór dopływu argonu, a następnie ostrożnie pociągnij nebulizator do tyłu, aby wyjąć go z komory rozpylnej.

Następnie odkręć rurkę do wprowadzania próbek i odłóż ją na bok. Odkręć połączenie doprowadzające gaz pomocniczy, aż lekko się poluzuje, a następnie zdejmij nebulizator. Na koniec, używając tej samej strzykawki i rurki, co pokazano wcześniej, oczyść oba porty nebulizatora 5% Citronem i przechowuj nebulizator zakryty w 5% Citronie do następnego użycia.

Odpowiednie płukanie cytometru masowego wodą UE i roztworem płuczącym DVS zredukuje poziom adsorpcji metali na przewodach i innych częściach urządzenia, co pomoże zmniejszyć tło widoczne na tych wykresach. Nieprawidłowe strojenie, reprezentowane przez linię magenta, znacząco zwiększyło tworzenie się tlenków przy m plus 16 w porównaniu z prawidłowo zestrojonymi próbkami, co obrazuje ciemnoniebieska linia. Powoduje to niewielki spadek pożądanych sygnałów przy m oraz znaczny wzrost niepożądanych zakłóceń tła przy m plus 16.

Właściwe przemywanie i odpowiednie rozcieńczenie próbek w wodzie Milli Q zapewnią minimalne tło i najwyższą rozdzielczość komórek, przy jednoczesnym zachowaniu szybkości procesu. Podobnie jak w przypadku danych z reprezentatywnego eksperymentu przedstawionego tutaj, w trybie akwizycji komórek analizowano kulek polistyrenowych zawierających naturalną obfitość lantanu 139, neodymu 140, terbu 159, dysprozu 169 i lutetu 175. Dane przeanalizowano za pomocą oprogramowania FlowJo, a zanieczyszczenia pochodzące z uszkodzonych kulek zostały wykluczone za pomocą bramkowania.

Ustalono, że prawidłowo dostrojona próbka odpowiada szybkości przepływu 0,74 litrów na minutę, co przedstawiono za pomocą ciemnoniebieskiej linii. Przy tej szybkości przepływu zaobserwowano wyższe intensywności sygnału niż przy niższych szybkościach przepływu; odnotowano również, że prawidłowo dostrojona próbka wykazywała silniejszy sygnał przy masach metali M oraz słabszy sygnał przy masach tlenków m+16 w porównaniu do sygnałów nieprawidłowo dostrojonych. Poniżej przedstawiono powiększenie sygnału przy masie M dla LANTHANUM 1 39 i THULIUM 1 69.

Należy zauważyć, że przepływ gazu uzupełniającego wpływa na intensywność sygnału LANTHANUM 1 39 w większym stopniu niż na intensywność sygnału thulium 1 69. Wykresy te przedstawiają sygnał dla mas tlenków m plus 16 wynoszących 1 55 oraz 180 5, odpowiadających odpowiednio tlenkom LANTHANUM 1 39 plus oh 16 i thulium 1 69 plus oh 16. Zauważcie, że przepływ gazu uzupełniającego znacznie bardziej zwiększa sygnał dla masy 1 55 niż dla masy 180 5, ponieważ lantan 1 39 utlenia się łatwiej niż tul 1 69.

Przedstawiono tutaj intensywności sygnałów m oraz m plus 16 w funkcji natężenia przepływu gazu uzupełniającego. Wypełnione ikony reprezentują masę M, natomiast puste ikony reprezentują masę M plus 16, a kolory linii odpowiadają odpowiedniej masie M. Należy zauważyć, że intensywności sygnałów LANTHANUM 1 39 oraz price ODIUM 1 41 są w dużym stopniu zależne od natężenia przepływu gazu uzupełniającego, osiągając nawet punkt, w którym obecna jest większa ilość tlenku o masie m plus 16 niż masy M. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak prawidłowo uruchamiać CyTOF, dostrajać go, a następnie analizować próbki i na koniec właściwie czyścić oraz wyłączać urządzenie po zakończeniu codziennych pomiarów.