Oznaczanie tolerowanych stężeń kwasów tłuszczowych i toksyny przy użyciu ludzkich komórek nabłonka jelitowego i mysich makrofagów BALB/c

Ogólnym celem tej procedury jest określenie tolerowanych stężeń kwasów tłuszczowych i toiny, które nie wpływają negatywnie na przeżycie komórek. Osiąga się to poprzez najpierw wyhodowanie odpowiedniego typu komórek. Drugim krokiem jest inkubacja komórek o różnych stężeniach trzech badanych kwasów tłuszczowych lub z toksyną.

Po 24 godzinach przeżywalność komórek ocenia się za pomocą testu MTT. Ostatecznie dane spektrometryczne z testu MTT wskazują na optymalne stężenia kwasów tłuszczowych i toksyny, którymi można leczyć komórki bez znacznego zmniejszenia przeżywalności. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku zapobiegania zakażeniom, ponieważ szczepienia nie zawsze są skuteczne.

Makrofagi mięśniowe łosia od myszy jelitowych C zostaną użyte do wszystkich oznaczeń toksyny co oraz do oznaczania stężenia kwasów tłuszczowych na większą skalę, komórki rozmnaża się w jednym z dwóch pożywek, DMEM z L-glutaminą uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% antybiotykiem przeciwgrzybiczym lub pożywką zasadową RPMI 1640 uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą, 5% L-glutaminy i 1% antybiotyk. Przeciwgrzybicze W tym protokole hoduj komórki C jelita w kolbach Corning o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych z wentylowanymi nakrętkami w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 95% powietrza i 5% dwutlenku węgla dla drobnej kamienia. Do oznaczania stężenia kwasów tłuszczowych wykorzystuje się ludzkie komórki nabłonka jelitowego rozmnażane w kolbach Corning o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych z wentylowanymi nakrętkami w pożywkach hiperopiekuńczych uzupełnionych 10% FPS i 30 nanogramów na mililitr.

Ludzki EGF nie używa antybiotykowych odczynników przeciwgrzybiczych zgodnie z instrukcjami producenta inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 95% subkultury powietrza i 5% dwutlenku węgla, wszystkie komórki od jednej do trzech przy około 70% płynności Co, w zależności od rodzaju komórek komórkowych, są zwykle subkulturowane co dwa do pięciu dni przed leczeniem kwasami tłuszczowymi. Przygotuj kwasy tłuszczowe najpierw przenieś kwasy oleinowy, linolowy i linolowy z dostarczonej przez firmę szklane ampułki do sterylizowanych szklanych fiolek. Następnie przenieś każdy kwas tłuszczowy do osobnej wysterylizowanej probówki einor.

Rozpuść każdy kwas tłuszczowy w 100% etanolu w rozcieńczeniu od jednego do sześciu, a następnie wprowadź edycję RPMI 1640. Niekompletne podłoża do końcowego stężenia 10 mikrogramów na mikrolitr. Zwiruj każdy roztwór i przenieś go do szklanych fiolek w celu przechowywania na płycie zamrażarki o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Ludzkie komórki nabłonka jelitowego w ilości 2 500 komórek na studzienkę na 96. Do studni na płytkach do hodowli tkankowych dodaje się odpowiednie kompletne podłoże, aby doprowadzić całkowitą objętość każdej studzienki do 200 mikrolitrów. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 95% powietrza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny.

Po 24-godzinnym okresie proliferacji wyjmij nośnik. Dodać odpowiednie stężenia każdego kwasu tłuszczowego, który ma być badany, do studzienek jako kontrolę pozytywną. Inkubować komórki z kompletną pożywką jako kontrolą ujemną, inkubować komórki z 70% etanolem.

Następnie dodaj całe podłoże, aby całkowita objętość każdej studzienki wynosiła 200 mikrolitrów. Inkubować płytki poddane działaniu wirusa przez 24 godziny przed rozpoczęciem testu MTT w celu przygotowania toksyny do leczenia komórkowego. Rozpuść toksynę w PBS w stężeniu jednego miligrama na mililitr.

Roztwór należy rozmieścić w fiolkach kriogenicznych i przechowywać w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza przed leczeniem komórek. Rozcieńczyć toksynę od jednego do stu w wysterylizowanym PBS lub niekompletnym DMEM, aby uzyskać końcowe stężenie robocze jednego nanograma na mikrolitrową płytkę. Makrofagi w 2 500 komórkach na studzienkę w 96.

Dobrze płytki do hodowli tkankowych inkubuje się w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 95% powietrza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Po 24-godzinnym okresie namnażania należy usunąć pożywkę i dodać do studzienek odpowiednie stężenia testowe toiny. Podobnie jak w przypadku leczenia kwasami tłuszczowymi, inkubuj komórki z kompletną pożywką jako kontrolą pozytywną i 70% etanolem jako kontrolą ujemną dla wszystkich próbek i zabiegów.

W przypadku kontroli dodatnich należy użyć co najmniej trzech powtórzeń z większą liczbą powtórzeń. Dodaj całe media, aby zwiększyć całkowitą objętość każdej studzienki do 200 mikrolitrów. Inkubować płytki poddane działaniu toksyny przez 24 godziny przed rozpoczęciem testu MTT.

24 godziny po potraktowaniu komórek kwasami tłuszczowymi lub barwnikiem toinowym żywotność komórek określa się za pomocą testu MTT. Usuń roztwór z każdej studzienki z 96-dołkowej płytki, która ma być testowana, i zastąp go 200 mikrolitrami. Świeże, kompletne rozwiązanie multimedialne.

Do każdego dodaj 10 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu MTT o stężeniu 2,5 miligrama na mililitr. Dobrze inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do czterech godzin. Po trzech do czterech godzinach wyrzuć roztwór pożywki i dodaj do każdego 100 mikrolitrów 0,04 molowego kwasu solnego w izopropanolu.

Dobrze inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie przenieś roztwór z każdej studzienki do wirówki wirówkowej o stężeniu 20 000 GS przez jedną minutę lub do momentu powstania osadu. Przenieść od 20 do 40 mikrolitrów każdej próbki do czytnika mikropłytek i odczytać absorbancję przy 570 nanometrach za pomocą spektrofotometru.

Rysunek ten przedstawia przeżywalność większości makrofagów przedstawionych jako funkcja kontroli pozytywnej dla zabiegów wykorzystujących rosnące stężenia kwasu oleinowego, kwasu linolowego i kwasu linolowego. Oczywiste jest, że komórki nie tolerują stężeń powyżej 100 nanogramów na mikrolitr dla żadnego z kwasów tłuszczowych. Eksperyment powtórzono przy użyciu ludzkich komórek nabłonkowych dla stężeń niższych niż 100 nanogramów na mikrolitr w przyrostach co 10 nanogramów na mikrolitr, do 70 nanogramów na mikrolitr

Ten wykres pokazuje przeżycie komórek dla każdego stężenia kwasu oleinowego. Jeden ze sposobów, w jaki Inova wskazała, że jedna lub więcej średnich różniła się statystycznie. Jednak tylko zabiegi w wyższych stężeniach sprawiły, że średnie statystycznie różniły się od tych z kontroli pozytywnej.

Co ciekawe, zaobserwowane różnice wynikały ze wzrostu żywotności komórek przy większej zmienności. Podobne wyniki uzyskano dla kwasu linolowego i linolowego. W jedną stronę.

Inova wskazała, że żaden ze środków leczenia nie różnił się statystycznie od średniej kontroli pozytywnej, ale zmienność wydaje się wzrastać w przypadku niektórych wyższych stężeń, takich jak 60 nanogramów na mikrolitr kwasu linolowego lub kwasu linolowego z tych wyników. Optymalne stężenia kwasów tłuszczowych przy użyciu ludzkich komórek nabłonka jelitowego wydają się wynosić od jednego do pięciu nanogramów na mikrolitr. Wpływ różnych stężeń toksyny kołnierzowej na przeżywalność większości makrofagów badano również z leczeniem poziomów toksyn w stosunkowo dużych przyrostach.

Zaobserwowano tendencję spadkową żywotności komórek, ponieważ oczekiwana żywotność komórek różniła się znacznie dla każdego leczenia. Duża zmienność żywotności spowodowała brak znaczącej różnicy między średnią kontroli pozytywnej z którymkolwiek z zabiegów, co doprowadziło do dalszych badań poziomów toksyn wynoszących 100 nanogramów lub mniej. Ten wykres pokazuje żywotność komórek w przypadku leczenia mniejszym poziomem toksyn.

Żywotność komórek jest bardzo zmienna dla prawie wszystkich stężeń toksyn, chociaż w wyniku leczenia zaobserwowano niewielki wzrost żywotności. Wzrosty te nie są statystycznie istotne dla żadnego z badanych produktów w porównaniu ze średnią z kontroli dodatniej. Na podstawie tych wyników.

Zalecane stężenie toksyny barwnej wynosi mniej niż 30 nanogramów na zabieg przy użyciu makrofagów myszy jelita C Po jej rozwinięciu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się kolorem lub badaniami, aby zbadać, czy kwasy tłuszczowe mogą wzmacniać odporność na zakażenie wirusem.