Mikromacierze DNA: kontrola jakości próbek, hybrydyzacja i skanowanie macierzy

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie eksperymentu z wykorzystaniem mikromacierzy przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia mieszającego. Jest to realizowane poprzez wstępną analizę jakości próbek RNA za pomocą bioanalizatora po amplifikacji i znakowaniu RNA. Próbki RNA są następnie hybrydyzowane z mikromacierzyami.

Na koniec zhybrydyzowane mikromacierze są płukane i skanowane. Ostatecznie uzyskuje się wyniki wykazujące różnicową ekspresję transkryptów RNA poprzez analizę obrazów z dwukolorowej fluorescencyjnej mikromacierzy. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy hybrydyzacji mikromacierzy są trudne do opanowania ze względu na specjalistyczny sprzęt.

Analiza kontroli jakości rozpoczyna się od przygotowania instrumentu bioanalyzer 2100 oraz stacji do przygotowania chipów zgodnie z instrukcją w pisemnej procedurze. Następnie matrycę żelową filtruje się, pipetując 550 µL do filtra wirowego dostarczonego w zestawie RNA 6000 nano kit. Filtr wiruje się przy 1500 RCF przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie podziel przefiltrowany żel na aliquoty po 65 µL, które można przechowywać w temperaturze 4 °C do jednego miesiąca. Wymieszaj koncentrat barwnika na wirówce typu vortex przez 10 sekund i dodaj 1 µL do aliquotu o objętości 65 µL. Po wymieszaniu przefiltrowanego żelu odwiruj próbki przy 13 000 RCF przez 10 minut w temperaturze pokojowej przed przystąpieniem do analizy.

Najpierw umieść chip na stacji przygotowawczej. W tej demonstracji zastosowano chipy RNA 6,000 nano. Nalej dziewięć µL mieszaniny barwnika do żelu do dołka oznaczonego białą literą G na czarnym tle.

Ustaw końcówkę pipety na samym dnie dołka. Ustaw tłok strzykawki na poziomie 1 mL i zamknij stację przygotowawczą. Powoli, ale jednostajnie naciskaj tłok, aż zostanie on zatrzymany przez klips.

Po 30 sekundach zwolnij zacisk i odczekaj kilka sekund, aż tłok się podniesie. Gdy tłok się zatrzyma, cofnij go do pozycji 1 ml i otwórz stację przygotowawczą. Nabierz 9 µL barwnika do żelu.

Wymieszaj zawartość w obu studzienkach. Następnie nanieś 5 µL znacznika Mark G do studzienki z drabiną oraz do każdej z 12 studzienek z próbkami. Następnie nanieś 1 µL zdenaturowanej drabiny do studzienki z drabiną oraz 1 µL każdej zdenaturowanej próbki do odpowiednich studzienek z próbkami.

Na koniec należy dodać jeden mikrolitr markera do każdej niewykorzystanej próbki. Po załadowaniu chipa, wstrząśnij nim w wortexie przez jedną minutę przy 2 400 RPM. Po uruchomieniu oprogramowania 2 100 expert, umieść chip w odpowiedniej pozycji i zamknij pokrywę.

Upewnij się, że wybrano odpowiedni port i przeprowadź analizę w ciągu pięciu minut od nałożenia próbek, aby zapobiec parowaniu. Metody przeprowadzania amplifikacji i znakowania RNA znajdują się w protokole pisemnym. Po znakowaniu oczyść CRNA, aby usunąć nieinkorporowane nukleotydy. Przy użyciu kolumn cogens r an easy mini można następnie oznaczyć ilość znakowanego CRNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop 2000.

W trybie pomiaru mikromacierzy należy zapisać stężenie próbki, wydajność oraz aktywność właściwą. W przypadku hybrydyzacji mikromacierzy konieczne jest uzyskanie wydajności wynoszącej co najmniej 825 nanogramów oraz aktywności właściwej wynoszącej co najmniej osiem pikomoli na mikrogram na co najmniej dwie godziny przed hybrydyzacją mikromacierzy. Włączyć stację hybrydyzacji i ustawić temperaturę na 65 °C.

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie macierzy Agilent 4x40 4K z systemem hybrydyzacji Roche NimbleGen i czterema komorami mieszającymi. Po fragmentacji cRNA przeprowadzonej zgodnie z opisem w protokole pisemnym, należy przygotować komorę hybrydyzacyjną. Umieść slajd z mikromacierzą w narzędziu do montażu i demontażu stroną z kodem kreskowym do dołu. Najpierw otwórz mieszalnik A i odsłoń klej utrzymujący macierz oraz narzędzie do montażu i demontażu, aby zapobiec jakimkolwiek przesunięciom.

Umieść mieszalnik A4 na szkiełku, zaczynając od dalszego końca. Upewnij się, że jest on prawidłowo wyrównany względem narzędzia, a następnie przytwierdź mieszalnik wzdłuż matrycy. Pociągnij szkiełko za koniec mieszalnika, aby usunąć zespół szkiełko-mieszalnik.

Używając narzędzia do dociskania, dociśnij całą krawędź uszczelki klejącej, aby upewnić się, że jest ona szczelnie przyklejona do szkiełka. Na ciemnym tle można dostrzec małe pęcherzyki powietrza uwięzione między klejem a szkiełkiem. Poświęć dodatkowy czas na usunięcie tych pęcherzyków za pomocą narzędzia do dociskania.

Matryca jest teraz gotowa do załadowania. Należy użyć pipety wypierającej dodatnio, aby nabrać 100 µL próbki do hybrydyzacji. Należy mocno wsunąć końcówkę do otworu i powoli oraz płynnie dozować ciecz, aby w obszarze matrycy nie uwięzło powietrze.

Gdy próbka pokryje całą matrycę i ciecz zacznie wypływać przez otwór odpowietrzający, szybko wyjmij pipetę, zwalniając jedynie tłok. Po odsunięciu końcówki od szkiełka delikatnie odsącz nadmiar cieczy z obu otworów, dbając o to, aby nie wyciągnąć próbki z samej komory. Następnie za pomocą pęsety zaklej otwory naklejkami.

Umieść preparat na stacji do hybrydyzacji i upewnij się, że otwory w pęcherzyku są prawidłowo ustawione nad uszczelkami typu O-ring. Zapewni to właściwe mieszanie podczas hybrydyzacji. Zamknij pokrywę preparatu oraz pokrywę stacji.

Ustaw stację w trybie mieszania B i przeprowadź hybrydyzację macierzy w temperaturze 65 °C przez 17 godzin. Po zakończeniu procesu napełnij szklaną szalkę oznaczoną jako A buforem do płukania 1; szalka powinna być wystarczająco duża, aby pomieścić narzędzie do montażu i demontażu oraz umożliwić swobodne manewrowanie. Wszystkie etapy płukania należy przeprowadzać w naczyniach szklanych, ponieważ plastik ma tendencję do uwalniania związków, co skutkuje wysokim tłem w macierzy.

Do naczynia do barwienia włóż kasetkę na preparaty oraz mieszadło magnetyczne. Naczynie oznaczone literą B napełnij buforem do płukania 1 tak, aby zakryć kasetkę, a następnie postaw naczynie na mieszalce magnetycznej w temperaturze pokojowej. Dodatkowo, do pustego naczynia do barwienia oznaczonego literą C włóż mieszadło magnetyczne i postaw je na mieszalce magnetycznej.

Wyjmij macierz ze stacji hybrydyzacji i umieść ją w narzędziu do montażu i demontażu. Zanurz cały zestaw w naczyniu, trzymając jednocześnie narzędzie do montażu i demontażu oraz szkiełko przeciwnymi stronami w jednej dłoni. Ostrożnie odklej mieszalnik A4, uważając, aby nie porysować obszaru macierzy.

Szybko umieść preparat na statywie i w naczyniu do barwienia B. Należy zminimalizować ekspozycję na powietrze, ponieważ barwnik SCI five jest wrażliwy na ozon. Płucz preparat przez jedną minutę, mieszając z umiarkowaną prędkością. Napełnij naczynie do barwienia C podgrzanym buforem płuczącym dwa.

Przenieś preparaty i płucz przez jedną minutę. Po płukaniu bardzo powoli wyjmij kasetę z naczynia barwiącego C, aby zminimalizować liczbę kropel pozostałych na szkiełku. Wysusz preparat, wirując przez dwie minuty.

Następnie należy umieścić preparat w probówce stożkowej o pojemności 50 ml i wypełnić ją argonem, a następnie niezwłocznie przeprowadzić skanowanie za pomocą skanera GenePix 4000B firmy Molecular Devices, aby uniknąć utraty sygnału. Oto przykłady czterech próbek RNA wyizolowanych z ludzkiego mózgu. Jakość próbek tkanki nowotworowej oceniono za pomocą analizatora 2100 na chipie RNA 6000.

Zamknięte i otwarte groty strzałek wskazują odpowiednio pozycje frakcji 18 s i 28 S-R-R-N-A. Wskaźnik integralności RNA, czyli RIN, jest ilościową miarą jakości RNA. Próbki wysokiej jakości całkowitego RNA powinny wykazywać tylko dwa główne piki podczas analizy w bioanalizatorze w ramach kontroli jakości, odpowiadające dwóm głównym gatunkom rybosomalnego RNA.

Pewna degradacja RNA objawi się w postaci smugi przed pierwszym pikiem RNA rybosomalnego oraz znacznie niższym pikiem 28 S-R-R-N-A w przypadku silnej degradacji. RNA niskiej jakości będzie wykazywać szeroki pik lub serię pików przy niskich czasach retencji. Jednocześnie dwa piki RNA rybosomalnego będą miały bardzo niską intensywność lub nie będą w ogóle identyfikowalne.

Macierze wysokiej jakości powinny generować silny sygnał przy stosunkowo niskich wartościach PMT. Oczekuje się, że większość transkryptów będzie występować na podobnym poziomie w próbce badawczej i referencyjnej. Masowe, rozległe zmiany w ekspresji genów prawdopodobnie będą pozbawione znaczenia biologicznego.

W związku z tym większość matrycy powinna mieć kolor żółty, a nie zielony lub czerwony. Sygnały dobrej jakości powinny znajdować się w zakresie dynamicznym takim, aby histogramy sygnałów w pełni się pokrywały, co widać na wykresie rozrzutu obrazu matrycy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat przeprowadzania eksperymentu z matrycami mikroarray przy użyciu zautomatyzowanego aparatu do hybrydyzacji.