Wysokorozdzielcza przyżyciowa mikroskopia pasiasta ośrodków rozrodczych

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie standardowego mikroskopu dwufotonowego do obrazowania intrażyciowego w wysokiej rozdzielczości. Osiąga się to poprzez uprzednie ustawienie mikroskopu, co obejmuje regulację laserów. Następnie multiplekser wiązki jest wyrównywany, aby uzyskać idealny kształt wiązki i układ światła wiązki.

W przypadku skanowania wielowiązkowego, surowe obrazy są uzyskiwane poprzez zeskanowanie próbki z pasiastym wzorem oświetlenia. Na koniec stosuje się algorytm do obliczenia końcowego obrazu o wysokiej rozdzielczości. Ostatecznie mikroskopia świetlna w paski służy do pokazania szczegółów zachowania układu odpornościowego w centrach rozrodczych w węzłach chłonnych myszy, wcześniej niedostępnych dla mikroskopii wewnątrzżyciowej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak oświetlenie strukturalne lub mikroskopia lokalizacyjna, jest to, że można ją stosować na dużych głębokościach tkanek w żywych próbkach. Nie wymaga żadnej modyfikacji kształtu wiązki laserowej, dzięki czemu metoda jest bardzo prosta i łatwa do wdrożenia w każdym mikroskopie wielofotonowym. Konfiguracja używana do wielowiązkowej mikroskopii z dwoma fotonami w paski jest pokazana tutaj w celu osiągnięcia optymalnej rozdzielczości i jakości kontrastu przy najniższym poziomie wybielania zdjęć i najszybszej akwizycji.

Rozważ wprowadzenie zmian w konfiguracji zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po dokonaniu regulacji sprawdź, czy wiązka dociera z powrotem do lustra, które znajduje się bezpośrednio nad lustrem wejściowym na końcu kompresora impulsów opartego na pryzmacie. Po ustawieniu ścieżki światła z tego miejsca, wiązka jest odbijana do multipleksera wiązki.

W przypadku wykonywania wielowiązkowego oświetlenia pasiastego, mikroskopia wielofotonowa przy wyłączonym skanerze. Wyrównaj lustra w multipleksie wiązki, umieszczając jednorodnie fluoryzującą próbkę na stoliku i skoncentruj wiązkę laserową wewnątrz próbki, ale w pobliżu górnej powierzchni. Blisko przedniej soczewki obiektywu.

Ustaw mikroskop w trybie wielowiązkowym i wybierz liczbę wiązek oraz polaryzację. Na przykład P, aby znaleźć wiązkę laserową, obrazując szkiełko fluorescencyjne, otwórz migawkę P i uruchamiaj kamerę CCD w sposób ciągły, jednocześnie skupiając wiązkę, upewniając się, że znajduje się w pozycji środkowej. Podczas ustawiania wiązki P przełącz na tryb 64 wiązek i otwórz odpowiednią migawkę.

Sprawdź położenie belki. Regulacja lusterek multipleksera od pierwszej do piątej, upewniając się, że światła wiązki są jednakowo oddalone. Ponieważ algorytmy oświetlenia pasiastego opierają się na tym założeniu, zastąp jednolicie fluorescencyjną próbkę próbką o niejednorodnej strukturze.

Na przykład próbka korzeniowa obszaru Conval i zeskanuj obraz wielowiązkowy. Sprawdź, czy obraz jest ostry, jednolity i prosty. Zastąp próbkę niejednorodną próbką jednorodną.

Uruchom skaner XY, aby kontrolować proces skanowania. Do generowania wzorca wzbudzenia obrazu rozłożonego dla skanowania wielowiązkowego. Przesuń lustro skanera Y prostopadle do linii podświetlonej wiązki.

Powtórz wygenerowany wzór wskazywany tutaj przez liczbę bloków, przesuwając lustro skanera X, tutaj zwane przesunięciem bloku, aby wygenerować prostokątny obraz w paski. Umieść heterogeniczną próbkę z powrotem i użyj skanera jako głównego spustu. Zsynchronizuj aparat ze skanerem, aby automatycznie pobierać i zapisywać obraz w paski w celu wielokrotnego uzyskiwania obrazów rozłożonych.

Przesuń lustro skanera X w różne pozycje, wybierając tutaj wystarczającą liczbę kroków powtórzeń, liczbę zmian i odpowiednią długość kroku tutaj. Przesuwanie kroku między dwoma kolejnymi obrazami w paski, aby objąć odległość między dwiema kolejnymi szerokościami belki. Ustaw przesunięcie X na wartość, która jest poniżej limitu rozdzielczości bocznej przy danej długości fali wzbudzenia.

Na przykład użycie 10 kroków lustra skanera X na zmianę i 12 lub 13 zmian prowadzi do najlepszej rozdzielczości przestrzennej. Wyniki z elementem głównym obszaru konwalescencji przesuwają się, aby zoptymalizować te dwie wartości, aż obraz obszaru konwalacji stanie się najostrzejszy. Użyj narzędzia profilu liniowego na konwencjonalnych obrazach CCD i obliczonych obrazach oświetlenia w paski.

Porównaj szerokość profili linii, która w tym przykładzie jest sygnałem fluorescencyjnym ze ścian komórkowych konwaloryzacji. Zdobądź każdy surowy obraz w paski zsynchronizowany z ruchem skanera i zapisz go osobno, na przykład w formacie TIFF lub plikach binarnych. Aby wygenerować dwuwymiarową macierz obrazu oświetlenia w paski o wysokiej rozdzielczości, należy otworzyć kompletny zestaw surowych obrazów w paski jako matryce w procedurze oceny.

Użyj algorytmu minimalnego maksimum lub algorytmu opartego na transformacji Fouriera, jak opisano wcześniej szczegółowo, aby wykonać oświetlenie pasiaste, wielowiązkową, wielopunktową mikroskopię fotonową w głębokich tkankach. W żywych organizmach uzyskuj pasiaste obrazy na różnych głębokościach tkanek w czasie i oceniaj je zgodnie z wcześniejszym opisem, aby wygenerować film 3D o wysokiej rozdzielczości dynamicznej interakcji między centrum rozrodczym, komórkami B i pęcherzykowymi komórkami dendrytycznymi. Wymiary efektywnej funkcji rozproszenia punktowego odpowiadają rozdzielczości przestrzennej mikroskopu.

Zmierzyliśmy tę trójwymiarową funkcję, uzyskując albo sygnał generacji drugiej harmonicznej włókien kolagenowych, albo sygnał fluorescencyjny 100 nanometrowych kulek polistyrenowych emitowanych na 515 nanometrach w węzłach chłonnych mion. Korzystając z naszego wielowiązkowego oświetlenia pasiastego T-P-L-S-M w porównaniu z dwoma sprawdzonymi technikami skaningowej laserowej mikroskopii skaningowej z fotonami, takimi jak detekcja pola T-P-L-S-M za pomocą kamer CCD i detekcja punktowa T-P-L-S-M. Z tych pomiarów staje się oczywiste, że na powierzchni próbki zarówno rozdzielczość boczna, jak i osiowa odpowiadają oczekiwanym wartościom przewidywanym przez teorię dyfrakcji.

Jednak wraz ze wzrostem głębokości obrazowania, a co za tym idzie wraz ze wzrostem drogi optycznej zarówno promieniowania wzbudzenia, jak i emisji przez ośrodek o bardzo zmiennych współczynnikach załamania światła, rozdzielczość przestrzenna ulega znacznemu pogorszeniu niezależnie od zastosowanej konfiguracji. Korzystając z M-B-S-I-T-P-L-S-M niezależnie od głębokości obrazowania, osiągnęliśmy około 20% lepszą rozdzielczość poprzeczną i 220% lepszą rozdzielczość osiową. W porównaniu ze standardowymi podejściami T-P-L-S-M.

Klonalna selekcja limfocytów B podczas odpowiedzi immunologicznej w wtórnych narządach limfatycznych dorosłych myszy jest pierwszym krokiem na ich drodze do różnicowania się w komórki B pamięci lub komórki plazmatyczne. Uważa się, że w tym procesie kluczową rolę odgrywa wysoce dynamiczna interakcja między pęcherzykowymi komórkami dendrytycznymi a komórkami B na poziomie struktur kompleksu immunologicznego w centrach rozrodczych. Tylko dzięki zastosowaniu technologii mikroskopii intrażyciowej o wysokiej rozdzielczości możliwe jest przeanalizowanie tej komunikacji komórkowej i jej implikacji dla odpowiedzi immunologicznej widocznej tutaj, oznaczonej anty CD 2135 FAB ATO five 90 na pęcherzykowych komórkach dendrytycznych.

M-B-S-I-T-P-L-S-M po raz pierwszy zapewnia możliwość inter vitalowej wizualizacji i ilościowego określenia wymiarów klastrów złogów kompleksu immunologicznego na głębokości do 120 mikronów w centrach rozrodczych węzłów chłonnych papy. Obrazy te pokazują bezpośrednie porównanie między obrazami fluorescencyjnymi 3D złogów kompleksu immunologicznego w centrum rozrodczym, uzyskanymi za pomocą konwencjonalnego PMT opartego na PMT i M-B-S-I-T-P-L-S-M. Co więcej, interakcje złogów kompleksu immunologicznego z komórkami B centrum rozrodczego mogą być wysoce rozdzielone i mogą być teraz badane w połączeniu z wewnątrzżyciowymi sondami funkcjonalnymi pod kątem proliferacji, różnicowania lub apoptozy.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że w przypadku techniki opartej na detekcji kamery prędkość akwizycji jest około osiem razy wyższa, podczas gdy maksymalna głębokość obrazowania jest o około 25% niższa niż w przypadku standardowego mikroskopu wielofotonowego opartego na fotopowielaczu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować mikroskop wielokrotny do pracy z metodą oświetlenia pasiastego, w tym regulację ścieżki światła mikroskopu, wyrównanie szerokości wiązki, obliczanie parametrów skanowania oraz sposoby obliczania końcowego obrazu o wysokiej rozdzielczości. Do przyżyciowych eksperymentów z głębokimi tkankami.