Wizualizacja i kwantyfikacja oddziaływań wewnątrzkomórkowych Neisseria meningitidis oraz ludzkiej α-aktyniny za pomocą obrazowania konfokalnego

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest ocena poziomu kolokalizacji zinternalizowanych bakterii, RIA Meningitidis, z białkiem cytoszkieletowym Alpha Actinin. Osiąga się to poprzez zakażanie hodowlanych ludzkich mikro naczyniowych komórek mózgu nocną kulturą bakterii przez okres od trzech do ośmiu godzin, aby umożliwić bakteriom wniknięcie do komórek docelowych. W drugim kroku komórki zawierające wewnątrzkomórkowe bakterie są płukane, utrwalane, a następnie permeabilizowane, co przygotowuje zakażoną kulturę do immunobarwienia zinternalizowanych bakterii oraz wewnątrzkomórkowej alpha actinin.

Po wykonaniu obrazowania konfokalnego i zastosowaniu oprogramowania do analizy kolokalizacji można zaobserwować obrazy wewnątrzkomórkowej kolokalizacji oraz uzyskać wyniki ilościowe, które wykazują, że Meninga Croci wykazująca ekspresję OPC, a także białko błonowe, mogą specyficznie oddziaływać z wewnątrzkomórkową alfa-aktyniną na podstawie wizualizacji mikroskopowej konfokalnej i ilościowej analizy kolokalizacji. Cześć, jestem Isel Maria z laboratorium profesora Mata TI w Katedrze Medycyny Komórkowej i Molekularnej na Uniwersytecie w Bri. Dzisiaj przedstawimy procedurę szacowania poziomu kolokalizacji bakterii wewnątrzkomórkowych z białkami cytoszkieletu.

Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania interakcji grzybni meningitis wykazującej ekspresję białka błonowego OPC z białkiem cytoszkieletowym alfa aktyną. Zatem możemy zacząć. Praca ta powinna być przeprowadzona w odpowiednim laboratorium bezpieczeństwa.

Na dwa dni przed procedurą barwienia immunologicznego zaszczep badany szczep bakteryjny na podłożu BHI (brain heart infusion). Płytki agarowe uzupełnione 10% podgrzewaną krwią konia należy inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 w dniu poprzedzającym barwienie immunologiczne. Użyj pętli do posiewów o pojemności 10 µL, aby przygotować zawiesinę z nocnej kultury bakterii.

W dwóch mililitrach PBSB pozostaw zawiesinę na pięć minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić opadnięcie dużych agregatów bakteryjnych. Następnie przenieś górny jeden mililitr zawiesiny do sterylnej probówki, nie naruszając osadu. Rozpuść bakterie, dodając jeden mililitr 1% SDS i 0,1 M wodorotlenku sodu do dwóch probówek zawierających 20 µL zawiesiny bakteryjnej, a następnie odwróć probówkę, aby wymieszać zawartość. W celu oszacowania liczby bakterii.

Zmierz zawartość kwasów nukleinowych, określając absorbancję roztworu. Przy 216 anters dostosuj gęstość zawiesiny bakteryjnej do wymaganej wartości w medium infekcyjnym przeznaczonym do zakażania ludzkich mikro naczyniowych komórek śródbłonka mózgu. Ludzkie mikro naczyniowe komórki śródbłonka mózgu lub H-B-M-E-C-A wysiane dwa dni przed immunobarwieniem umieść na 16 milimetrowych szklanych lamelkach w dołkach płytki 12-dołkowej i wysiej komórki HBME z 50% konfluencją na lamelkach; inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2, a następnego dnia.

Zakaź komórki świeżo przygotowaną zawiesiną bakteryjną w naszym laboratorium. Rutynowo stosuje się stosunek zakażenia od 200 do 300 jednostek tworzących kolonie na jedną komórkę docelową. Inkubuj od trzech do ośmiu godzin w temperaturze 37 °C w 5% CO2 do końca okresu zakażenia.

Przemyj komórki trzykrotnie za pomocą PBS i utrwal je, dodając 500 µL 2% paraformaldehydu na 30 do 45 minut w temperaturze pokojowej. Po wypłukaniu paraformaldehydu przeprowadź permeabilizację utrwalonych komórek, inkubując je w 0,1% Tritonie X 100 rozcieńczonym w PBS przez 10 minut. Na koniec przemyj próbki trzykrotnie PBS i przystąp do immunobarwienia zgodnie z instrukcją. Następnie można jednocześnie przeprowadzić barwienie bakterii wewnątrzkomórkowych oraz α-aktyniny.

W płytkach 12-dołkowych zablokować szkiełka przykrywowe zawierające przepuszczalne komórki, używając 500 µl 3% B-S-A-P-B-S-T przez 30 do 60 minut. W temperaturze pokojowej, po przemyciu PBS, przenieść każde szkiełko przykrywowe do nowego suchego dołka w płytce 12-dołkowej. Przeciwciała pierwotne przeciwko bakteriom oraz alfa-aktyninie dodać jednocześnie; wystarczające jest 80 do 100 µL przeciwciała na szkiełko przykrywowe, pod warunkiem ostrożnego dodania w celu pokrycia powierzchni szkiełka. Inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji dodać 200 µL PBS do dołka, podnieść szkiełko przykrywowe i umieścić je w nowym dołku zawierającym 500 µL PBS. Po pięciu minutach usunąć PBS za pomocą pipety, a następnie dodać świeży PBS. Powtórzyć tę czynność dwukrotnie i przenieść szkiełka przykrywowe do nowego suchego dołka.

Następnie należy dodać odpowiednie przeciwciała wtórne sprzężone z różnymi fluorochromami, rozcieńczone w 1%B-S-A-P-B-S-T. Inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę w ciemności; po zakończeniu inkubacji należy przeprowadzić przemywanie zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami, a następnie wybarwić DNA za pomocą DPI przez pięć minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Po zakończeniu tej inkubacji należy przemyć szkiełka nakrywki raz w PBS, a następnie zamontować je za pomocą kropli medium montażowego. Zamontowane szkiełka nakrywki powinny być przechowywane w ciemności do momentu ich obserwacji. Próbki z immunoznakowaniem obserwujemy i obrazujemy przy użyciu konfokalnego mikroskopu skaningowego z laserem, połączonego z odwróconym mikroskopem epifluorescencyjnym.

Aby rozpocząć procedurę CLSM, nanieś kroplę medium immersyjnego na obiektyw i umieść preparat z szkiełkiem nakrywką na stoliku mikroskopu, przełącz mikroskop w tryb wizualny i zlokalizuj obszar zainteresowania, korzystając z okularów mikroskopu; w tym momencie można przejść do obsługi oprogramowania Leica. Wybierz tryb akwizycji XY z. Do badań kolokalizacji wybierz format 512 na 512.

Im wyższa rozdzielczość, tym dokładniejszy obraz. Następnie należy wybrać dwukierunkowy tryb X, który zwiększy prędkość skanowania i pomoże ograniczyć fotoblaknięcie. Skonfiguruj ustawienia skanowania sekwencyjnego.

Kliknij w funkcję SEC, a następnie wybierz zakres linii. Wybierz wiązki laserowe zgodnie z fluorochromami sprzężonymi z przeciwciałami wtórnymi: 405 nm dla DPI, 488 nm dla Alexa Fluor 488 oraz 561 nm.

W przypadku trixy aktywuj odpowiednio fotopowielacze jeden, dwa i trzy. Ustaw górną i dolną granicę stosu Z lub serii. Następnie ustaw wielkość kroku Z na 0.2 µm.

RIA Mencius jest dyplokusm, a ponieważ każdy kaukus ma przybliżoną średnicę 0,5 micrometers, rozmiar kroku Z wynoszący 0,2 micrometers zwiększa prawdopodobieństwo zeskanowania każdego kaukusa co najmniej dwukrotnie. Ustaw końcowe parametry skanowania, wybierając uśrednianie linii dla trzech powtórzeń w celu poprawy stosunku sygnału do szumu, a następnie kliknij start. Obrazy z podwójnym lub potrójnym barwieniem uzyskuje się poprzez sekwencyjne skanowanie przy różnych długościach fal oraz stosując tryb między liniami dla każdego kanału, aby wyeliminować przesłuchy między różnymi chromoforami.

Aby wskazać kolokalizację dwóch fluorochromów, wybierz funkcję nakładania (overlay), aby połączyć wybrane kanały w jeden obraz. Na przykład, gdy Alexa 488 oraz trissy Fluor Chromes kolokalizują, w obrazie nałożonym pojawi się kolor żółty. W przypadku konieczności wykonania rekonstrukcji 2D w celu wizualizacji potencjalnej kolokalizacji, skompiluj stos Z lub serię, korzystając z funkcji maksymalnej projekcji (maximum projection). Po uzyskaniu stosu Z lub serii przetwórz dane, aby uzyskać obraz ortogonalny do wizualizacji wewnątrzkomórkowej lokalizacji poszczególnych elementów.

Ilościowe określenie kolokalizacji jest przeprowadzane przy użyciu oprogramowania Vol City dostarczonego przez IMP. Aby rozpocząć, należy utworzyć bibliotekę z obrazami CLSM, a następnie wybrać opcję rozszerzonego ogniska (extended focus) dla obrazu w górnym pasku. Narzędzie to połączy przekroje Z w jeden obraz 2D przeznaczony do analizy.

Teraz wybierz narzędzie KOLOKALIZACJA. Dwa analizowane kanały powinny mieć taką samą głębokość koloru. Wybierz obszar, który ma zostać poddany kwantyfikacji.

Ustaw próg odcięcia w celu usunięcia tła. Utwórz wynik kolokalizacji, wybierając opcję generowania kolokalizacji. Statystyki kolokalizacji zostaną wygenerowane dla wcześniej wybranych obszarów zainteresowania.

Następnie wybierz współczynniki Mandera R i ny. Na koniec wyeksportuj wartości statystyczne do dokumentu Excel w celu prezentacji danych; przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki obrazowania konfokalnego ludzkich komórek śródbłonka mózgu zainfekowanych meningokokami przez osiem godzin. Lokalizacja bakterii zaznaczona jest kolorem czerwonym.

Podczas gdy lokalizacja alfa-aktyniny jest pokazana, zielone strzałki wskazują obszary, w których prawdopodobnie doszło do znacznej akumulacji alfa-aktyniny wokół bakterii. Na tym obrazie nałożonym widocznych jest kilka regionów o kolorze żółto-pomarańczowym, co sugeruje kolokalizację między meninga occi a alfa-aktyniną. Na następnym obrazie sekcja optyczna zainfekowanej monowarstwy H-B-M-E-C wskazuje kolokalizację wokół bakterii wewnątrzkomórkowych znajdujących się u podstawy komórki.

Podczas przetwarzania obrazów trójwymiarowych zainfekowanych monowarstw H-B-M-E-C, widok skośny powierzchni apikalnej ukazuje bakterię Durant zabarwioną na czerwono, wskazaną czerwoną strzałką, podczas gdy kilka bakterii zlokalizowanych w kierunku powierzchni bazalnych komórek śródbłonka wskazano żółtą strzałką. Wyraźnie pomarańczowe i żółte zabarwienie w lokalizacji bazalnej jest widoczne bardziej przejrzyście w tym przekroju endon XZ. W przeciwieństwie do eksperymentów z aktyniną, w których przeprowadzono znakowanie zinternalizowanych bakterii oraz mentonu lub aktyny, wykazano sporadyczną kolokalizację z aktyną, lecz rzadką kolokalizację z fermentującymi w komórkach H-B-M-E-C.

Jak zaobserwowano w poprzednich eksperymentach, Retin skoncentrował się wokół kilku zinternalizowanych bakterii wskazanych białymi strzałkami. Dane przeanalizowano również w celu uzyskania względnego stopnia pokrycia. Współczynnik R, który według Manda reprezentuje rzeczywiste stopień kolokalizacji IE, czyli liczbę pikseli kolokalizujących się w stosunku do całkowitej liczby pikseli i wartości NY dla alfa-aktyniny, mentingu i aktyny ogółem w H-B-M-E-C zainfekowanych dwojnikami OPC, wykazał pokrycie rein w dwojnikach przekraczające 25%.

Współczynnik Y jest miarą częstotliwości występowania sygnału bardziej obfitego rein w każdym przypadku pojawienia się mniej obfitego sygnału meninga cocoa. Pomiar ten wykazuje uderzający poziom występowania alfa aktyniny w sąsiedztwie zinternalizowanych meninga cockeye. Przedstawiamy sposób wizualizacji i kwantyfikacji kolokalizacji zinternalizowanych bakterii z elementami cytoszkieletu w ramach niniejszego eksperymentu.

Ważne jest, aby ściśle przestrzegać protokołów utrwalania i barwienia immunocytochemicznego, aby zachować integralność struktur i uniknąć wysokiego tła. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.